近期，北京大学口腔医（学）院刘云松教授和北京大学口腔医（学）院徐永祥副教授在科爱出版创办的期刊Bioactive Materials上联合发表论著文章：光固化Col/PCL/Mg复合引导骨再生膜的时空维持性能和成骨性能研究。设计了一种新型光固化胶原/甲基丙烯酰化聚己内酯/镁（Col/PCLMA/Mg）复合膜，该膜在光固化后提供时间和空间的支撑作用，并能促进骨组织再生。

01研究内容简介

骨吸收影响牙种植体的种植成功率和长期临床疗效。引导骨再生 (GBR) 是用于修复水平和垂直牙槽缺损的最常见的策略，并已取得不错的临床效果。GBR 膜，也称为屏障膜，在骨缺损修复中起到防止结缔组织和上皮迁移到缺损处以及为植入部位的骨再生保留空间的作用。

根据最新修订的临床指南，理想的GBR膜应具备以下特点：生物相容性、屏障作用、空间创造能力、与周围组织结合或附着的能力和临床管理性。多种材料已被用作GBR 膜，比如，如胶原蛋、聚四氟乙烯、钛、壳聚糖、聚乳酸和聚己内酯等。这些GBR膜可大致分为两类：可吸收GBR膜和不可吸收GBR膜。然而，这些膜都无法满足以上所有要求。可吸收GBR膜已有多种商业可用的膜，其主要成分为胶原，其在促进成纤维细胞增殖和增强成骨细胞粘附方面显示出优异的生物相容性，但是，胶原膜缺乏空间制造能力并且降解过快，只能保持屏障作用约 30 天 。相比之下，不可吸收GBR膜具有良好空间制造能力和屏障作用，但需要二次手术取出，增加了患者的痛苦和感染的风险。因此，有必要开发一种新型的GBR复合膜。

聚己内酯（PCL）因其卓越刚性、机械强度和生物相容性，已用于组织工程再生骨、皮肤和血管组织，其是一种半结晶脂肪族聚酯，由五个亚甲基和一个酯基的重复单元组成，在体内可降解，降解产物在体内或体外不会有细胞毒性作用。有学者将 PCL 的一种新型衍生物，甲基丙烯酰化聚己内酯(PCLMA) ，应用于组织工程支架，光交联后表现出优异的生物相容性、生物降解性和机械性能。随后该学者又使用甲基丙烯酰化明胶和 PCLMA 制造组织支架同样具有良好的生物相容性。PCL 用于生物支架中主要起机械支撑。

可生物降解金属已被用作GBR膜的制备中，其中，镁 (Mg) 在细胞粘附和成骨活性方面表现良好。有学者制造了壳聚糖涂层的镁合金增强了细胞附着并降低了镁的降解速率。同时，有研究证明添加Mg颗粒可促进新型 PLGA 支架中的细胞增殖和成骨，所以，镁有望用于 GBR 和位点保存中。

在此，本研究开发了 Col/PCLMA/Mg 复合GBR膜， PCLMA 用于包裹胶原纤维以增加GBR膜的强度，并在光固化后减缓胶原降解，而Mg颗粒能够增强生物相容性和成骨性能，体外和体内评估了 Col/PCL/Mg 膜的机械性能和降解性能以及生物相容性。

一、材料制备

将甲基丙烯酰化聚己内酯加热至 40℃，与 TPO 按 100:0.5 (w/w) 的比例混合，形成均质的 PCLMA/TPO 溶液。将混合物以 50 mg/cm2 的浓度均匀涂布胶原膜的光滑表面，在 37℃下静置15min以确保 PCLMA 完全渗透到胶原中。为了获得类似固体的状态，将复合膜移至4℃静置10min，钴60辐射灭菌。最后，使用 405 nm 光源对复合膜进行光固化，以测试其机械性能和生物相容性，此光交联膜被命名为 Col/PCL膜。在 Col/PCL/Mg 组中，将直径为 100-150 μm 的Mg颗粒以 1:20 (w/w) 的比例加入均质PCLMA/TPO 溶液中，反复震荡并超声 30 min；然后遵循上述相同的程序。PCL组将具有 TPO 的 PCLMA 溶液在没有胶原膜的情况下直接光固化；对照是未经任何处理的胶原膜。

二、材料表征

甲基丙烯酰化聚己内酯在室温下呈蜡样固态，在37℃以上为液态。PCLMA在40℃下能完全渗入胶原膜。光固化后，PCL 和胶原紧密结合，形成类似于钢筋混凝土的互串网络结构的聚合物。Col、PCL、Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 膜的厚度为 300~600 μm。FT-IR 光谱分析复合膜的组分，光固化后得到的PCL的谱图中1,638 cm–1 处的酰胺 I 峰强度降低，而PCLAMA的具有明显的酰胺 I 峰（图１A）。Col/PCL 和 Col/PCL/Mg复合膜和 PCL 的光谱相似，但与 胶原膜的光谱不同（图１B）。图 1C 显示了光滑和粗糙表面和横截面的 SEM 显微照片。胶原膜粗糙表面上的胶原纤维呈直线状，而在光滑表面上则更密集。PCL 和 Col/PCL 组具有相对光滑的不含 Col 纤维的表面。在 Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 组中，PCL 填充了粗糙表面和截面上 Col 原纤维之间的原纤维间空间。值得注意的是，Mg 颗粒均匀地分布在 Col/PCL/Mg 膜的光滑表面上，能量色散光谱图显示 PCL 覆盖了 Mg 颗粒（图 1D 和 1E）。

Figure 1. Formulation and characterization of the photocrosslinkable composite membranes. Fourier transform infrared spectra of (A) PCLMA and photocrosslinked PCL, and (B) Col, PCL, Col/PCL, and Col/PCL/Mg membranes. (C) Scanning electron microscopy images showing the morphology of Col, PCL, Col/PCL, and Col/PCL/Mg membranes. Energy dispersive spectrometry (D) maps and (E) spectra of Col/PCL/Mg membranes; red, green, and blue colors represent elemental O, C, and Mg, respectively.

三、机械性能

四种不同膜片中， PCL 膜的弹性模量最低，Col/PCL 最高，为 454.97 ± 43.84 MPa（图 2A）。Mg颗粒掺入 Col/PCL/Mg 膜降低了弹性模量 (P > 0.05)。在三点弯曲实验中，PCL 膜的弹性模量甚至低于非浸没状态下的 胶原膜 (P < 0.05) (图 2B)。应力-应变曲线（图 2D）显示 Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 膜的最大强度远高于其他组。浸泡 PBS 后，Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 膜的模量远高于 胶原膜浸入后的模量（P < 0.05）（图 2C）。胶原膜完全失去了无法测量的支撑特性，而其他三组显示出相似的应力-应变曲线（图 2E）。溶胀行为如图 2F 所示，胶原膜在浸泡 24 小时和 72 小时后吸收的重量分别是其重量的两倍和三倍（P < 0.05），PCL 膜在浸泡后没有显示出重量变化， Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 膜的吸水率介于 Col 和 PCL 之间，浸泡 24 和 72 h 后没有变化（P > 0.05）。

Figure 2. Mechanical properties and Swelling behavior of the photocrosslinked composite membranes. (A) Elastic modulus derived from tensile testing of Col, PCL, Col/PCL, and Col/PCL/Mg membranes. Elastic moduli from flexure testing of the (B) original membranes and (C) membranes immersed in PBS for 1 day. Stress–strain curves derived from flexure testing of the (D) original membranes and (E) membranes immersed in PBS for 1 day. (F) Swelling behavior of Col, PCL, Col/PCL, and Col/PCL/Mg membranes. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 when compared with Col group)

四、降解行为

体外降解过程中各组GBR膜的光滑和粗糙表面的形态变化如图 3A 和 3B 显示，Col膜逐渐变松散，胶原纤维逐渐变细，在第 7 天几乎完全降解。根据扫描电镜观察，PCL 和 Col/PCL 膜的光滑表面几乎没有变化。然而，在 Col/PCL/Mg 组中，一些 Mg颗粒从光滑的表面脱落，表面残留凹坑状形态。有趣的是，Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 膜的粗糙表面明显改变，胶原纤维的外观从第 3 天开始逐渐模糊，并在第 4 周消失，在粗糙表面留下裂缝。图 3C 显示了体外降解过程中各组GBR膜的质量变化：Col膜的降解速度明显快于其他三种膜，胶原膜在第 7 天完全降解；在含有胶原酶的 PBS 中浸泡 4 周后PCL 膜几乎没有降解；Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 膜在 4 周后分别降解了约 12% 和 8%。另外，在降解过程中，Col、PCL 和 Col/PCL 组的 Mg2+ 离子浓度维持在 30 mg/L，这是 SBF 的基础浓度，而 SBF 浸没的 Col/PCL/Mg 组的释放量从第一天的490.30 mg/L 逐渐增加到 低7天846.67 mg/L（图 3D）。

体内降解质量变化如图 3E 所示：Col膜在植入大鼠皮下8周后完全降解，而PCL、Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 膜的重量在此期间下降了 50%，这大约对应其中胶原的重量；扫描电镜图像证实了这些发现。胶原纤维完全消失，在 Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 膜的粗糙表面上观察到裂纹。有趣的是，Col/PCL/Mg 膜的光滑表面发生了显着变化；Mg 颗粒完全消失，表面出现明显的凹坑（图 3F）。

Figure 3. Degradation behavior of membranes in vivo and in vitro. Scanning electron microscopy morphologies of (A) smooth and (B) coarse surfaces of Col, PCL, Col/PCL, and Col/PCL/Mg membranes after immersion in PBS containing collagenase for 12 h, 1 day, 1 week, and 4 weeks, and the corresponding mass changes of these membranes (C) in vitro and (E) in vivo. (D) Concentration of Mg2+ ions after soaking Col, PCL, Col/PCL, and Col/PCL/Mg membranes in simulated body fluid for 1, 3, 5, and 7 days. (F) Scanning electron microscopy morphologies of smooth and coarse surfaces of Col, PCL, Col/PCL, and Col/PCL/Mg membranes after implantation into subcutaneous tissue for 8 weeks (**p<0.01 when compared with Col group)

五、生物相容性

在孵育 24 小时后，活/死细胞染色显示在 胶原膜上有少数人牙龈成纤维细胞死亡，在其他三种类型的膜上没有观察到死亡的人牙龈成纤维细胞（图 4A）。值得注意的是，Col/PCL/Mg 组中的人牙龈成纤维细胞表现出潜在的增殖潜力。同样，在四种类型的膜上未观察到死亡的人骨髓间充质干细胞（图 4D）。至于细胞附着，共聚焦显微镜图像显示梭形人牙龈成纤维细胞，散布在所有四组的膜表面。扫描电镜成像显示 Col/PCL/Mg 组中拉伸的人牙龈成纤维细胞伪足（图 4B）， 在 人骨髓间充质干细胞中也观察到相同的结果 (图 4E)。最后，细胞增殖率显示所有组中人牙龈成纤维细胞 的增殖潜力相似（P > 0.05）（图 4C）。

Figure 4. Biocompatibility assessment. (A) Live/dead cell staining of HGFs. The red cells represent dead cells and the green represent live cells. (B) Attachment of HGFs to Col, PCL, Col/PCL, and Col/PCL/Mg membranes observed by LSCM and SEM. (C) Cell proliferation values of HGFs obtained using the Counting Kit 8 on days 1, 3, 5, and 7 in each group. (D) Live/dead cell staining of hBMSCs.  The red cells represent dead cells and the green represent live cells. (E) Attachment of hBMSCs to Col, PCL, Col/PCL, and Col/PCL/Mg membranes observed by LSCM.

六、成骨性能

碱性磷酸酶染色显示 Col/PCL/Mg 膜的浸提液成骨诱导培养有促进成骨的作用（图 5A）。碱性磷酸酶活性的定量计算进一步证明，与其他提取物相比，Col/PCL/Mg 膜的浸提液成骨诱导显著增强了成骨潜力（图 5B）。进一步分析了碱性磷酸酶的 mRNA 表达，与其他组相比，Col/PCL/Mg 组的表达增加了 4 倍（图 5C）。同时，Col/PCL/Mg 膜的成骨诱导浸提液分别在第 14 天导致 RUNX2、OCN 和 OSX 的mRNA 表达增强（图 5D-5F）。

Figure 5. Osteogenic efficiency in vitro. (A) Alkaline phosphatase activity and (B) quantitative alkaline phosphatase assay (n=3) after the hBMSCs were cultured in extracts for 7 days; Evaluating osteogenic differentiation of hBMSCs cultured in extract liquid by analyzing relative expressions of genes in relation to osteogenic differentiation: (C) ALP; (D) OCN; (E) OSX; (F) RUNX2. (*p<0.05, n=3).

在大鼠颅骨缺损的动物实验模型中，植入后 8 周，将颅骨样本进行微计算机断层扫描和组织切片染色(图 6A) 观察形态学变化。目视下，胶原膜中的缺陷完全被一层薄薄的新骨取代，而其他三组有少量未愈合的缺损。显微 CT 图像证实 PCL、Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 组中的新骨多于 胶原膜组。骨矿物质密度 (BMD) 分析和总骨体积 (BV) 测量值显示出相似的趋势，在 Col/PCL/Mg 组的值最大值 (P < 0.05) (图 6C 和 6D)。切片 H&E 染色显示 Col、PCL、Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 组的骨缺损处分布新的骨样组织。在 Col/PCL/Mg 组中，缺损处有更多的嗜酸性新骨样组织。同样，除了空白组，几乎所有组都观察到胶原蛋白（蓝色）。在 Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 组中观察到更多的胶原呈条索状排列。此外，OCN 的免疫组化染色呈现出相同的趋势（图 6B）。

Figure 6. Osteogenic efficiency in vivo. (A) Macro and micro CT images of new bone regeneration. (B) Hematoxylin–eosin, Masson, and immunohistochemical (IHC) staining of blank control, Col, PCL, Col/PCL, and Col/PCL/Mg groups after implantation into calvaria defects for 8 weeks. NB represents eosinophilic new bone like tissue, → represents collagen; (C) Bone mineral density of each group after reconstruction of micro CT images. (D) BV of each group after reconstruction of micro CT images. (*p<0.05, n=5).

综上所述，可光固化的 Col/PCL/Mg 复合GBR膜表现出良好的临床管理性，并且具有优异的机械性能和生物相容性，可作为传统 GBR 膜的替代品，在骨组织工程中具有潜在应用价值。

02论文第一/通讯作者简介

第一作者：王飞龙

北京大学口腔医（学）院2020级博士研究生，主要研究方向为新型GBR膜的应用。

第一作者：夏丹丹

北京大学口腔医（学）院副研究员，博士生导师。研究方向为口腔组织修复材料。

通讯作者：徐永祥

北京大学口腔医（学）院副教授，硕士研究生导师。主要研究方向为基于高分子的生物材料的分级结构调控及其对生物学性能的影响。近年来以通讯作者/第一作者在Bioactive Materials、Acta biomaterialia、Carbohydrate Polymers等期刊发表SCI收录论文10余篇。主持和参与国家自然科学基金等省部级项目多项；申请专利发明10余项，已授权6项。

通讯作者：刘云松

北京大学口腔医（学）院教授，博士生导师，口腔修复科主任。主要研究方向为口腔骨再生和生物活性材料开发。近年来，以第一负责人身份主持国家自然科学基金项目5项，主持省部级课题4项，院校交叉研究课题7项。以第一或通讯作者在Nano Today、Bioactive Materials、Small、Biomaterials、Acta biomaterialia等期刊发表SCI收录论文40余篇。授权国家专利7项，其中2项已经完成临床转化，形成成熟的临床产品。获中华口腔医学会科技奖一等奖1项，北京市教学成果一等奖1项，北京市科技奖2项。2017年获评“首都十大杰出青年医生”，2021年获评首届“北京大学杰出青年医师”。

03资助信息

该研究获国家自然科学基金(82170929、81970908、51901003、81200814 和 81771039)和创新研究计划（HHKT-00-03）的支持与帮助。

04原文信息

Feilong Wang, Dandan Xia, Siyi Wang, Ranli Gu, Fan Yang, Xiao Zhao, Xuenan Liu, Yuan Zhu, Hao Liu, Yongxiang Xu*, Yunsong Liu*, Yongsheng Zhou. 

Photocrosslinkable Col/PCL/Mg composite membrane providing spatiotemporal maintenance and positive osteogenetic effects during guided bone regeneration. 

Bioactive Materials, 13 (2022) 53-63.