目前在制药行业中，薄层色谱法已广泛应用于中药含量检测、中药材鉴别等领域，是一种成熟可靠、准确度高且被广泛认可的检测方法。笔者通过对其校准方法的研究应用，可确保仪器检测结果的准确性和溯源性，同时符合《中国药典》、《药品生产质量管理规范及附录》等法规文件的要求。

 

一、方法分析

 

1.性能指标

 

根据2018年9月25日实施的JJF1712-2018《薄层色谱扫描仪校准规范》，其主要性能指标如表1所示。

 

 

表1  仪器主要计量技术指标

 

2.校准条件

 

(1)实验室环境条件

 

环境温度:10℃～35℃；湿度:(15～70)%RH；周围无强烈振动，无强电、磁场干扰；供电电源:(220±22)V，(50±1)Hz。

 

(2)校准用标准物质及设备

 

点样器:经校准的10μL平头微量注射器；食用合成色素苋菜红溶液标准物质:0.500mg·mL-1(相对扩展不确定度为1%)；空白高效硅胶板；容量瓶:10；可调移液器:1000μL。

 

二、标准品配制

 

根据JJF1712-2018，需选用食用合成色素苋菜红溶液标准物质0.500mg·mL-1(相对扩展不确定度为1%)。经查询，中国计量科学研究院尚未发布该准确度的标准物质，仅有食用合成色素苋菜红溶液标准物质0.500mg·mL-1(相对扩展不确定度为2%)，编号GBW(E)100002a。为确保标准物质准确度适用，笔者通过不确定度比较，分析了这两种标准物质对最终检测结果的影响，结果证明相对扩展不确定度为2%的0.500mg·mL-1食用合成色素苋菜红溶液标准物质适用于薄层色谱扫描仪的校准要求，可接受使用。

 

按JJF1712-2018，使用1000μL可调移液器吸取标准物质母液，用色谱级乙醇稀释定容至10mL容量瓶中，配制浓度如表2所示。

 

 

表2  食用合成色素苋菜红标准溶液

 

三、薄层板的选择

 

根据JJF1712-2018，需使用高效硅胶板，而高效硅胶板根据其硅胶粒度、粘合剂类型、添加类型等条件的不同，分为多个类型:G板、GF板、F板、H板、高效硅胶G板等，例如硅胶G板表示含煅石膏粘合剂，硅胶H板表示不含粘合剂。通过对标准溶液的判断分析，初步选用常用高效G板。实验发现国产高效G板展开效果差，展开重复性差，对线性误差、同板重复性误差均有较大影响。换用某公司生产的高效板后，展开效果达到要求，图1为一般高效硅胶G板扫描结果，图2为高效硅胶G板(某公司)扫描结果(分析原因)。因此，笔者选用了高效硅胶G板(某公司)作为校准用硅胶板。

 

 

图1  普通高效G板展开结果图

 

 

图2  高效硅胶G板(某公司)扫描结果图

 

四、展开剂配制

 

由于JJF1712-2018未给出展开溶剂的配方，因此我公司自行调配展开剂。通过不同展开剂Rf值考察结果可见，其中展开剂[正丁醇∶无水乙醇∶氨水(1%)=6∶5∶3]Rf合适(0.5左右)，成点性较好，方法对不同品牌薄层板耐用性良好，展开如图3所示。

 

 

图3  标准品在不同薄层板上展开效果图

 

五、点样方法

 

JJF1712-2018使用了手工点板方法，而我公司使用的薄层色谱扫描仪配备了同厂家的自动点样仪器。经内部攻关小组商讨认为，手工点样受限于人员操作误差、环境因素影响等原因，点样误差大，自动点样误差相对较小，点样量重复性好，应结合实际采用自动点样方式。

 

六、点样位置及扫描方法

 

我公司内部攻关小组根据JJF1712-2018要求，分别点样三块薄层板。

 

1.线性误差

 

点样方法:分别吸取标准品1、2、3、4，在空白硅胶板上分别点样2μL，两斑点中心距至少为10mm，编号板1。

 

扫描方法:依次扫描线性误差对应斑点标准品1、2、3、4，每个点扫描3次，记录图谱的峰面积。

 

2.同点测量重复性

 

点样方法:吸取标准品4，在空白硅胶板上点样2μL，编号板2。

 

扫描方法:对相应斑点连续扫描7次，记录图谱的峰面积和比移值。

 

3.同板测量重复性

 

点样方法:吸取标准品4，在空白硅胶板上平行点样7次，点样体积1μL，编号板3。

 

扫描方法:依次扫描对应斑点，记录各点峰面积。

 

由于薄层板展开过程中存在“边缘效应”，小组在进行首次实验时未充分考虑该情况，点样位置未避开边缘，导致展开效果不佳，线性误差和同板重复性误差未达标。首次实验同板重复性点样方法如图4所示，扫描结果如图5所示(其中b4表示4号标准品，标准物质浓度为0.04mg·mL-1)。

 

 

图4  首次实验同板重复性点样方法

 

 

图5  首次实验同板重复性扫描结果

 

经过经验总结，小组成员调整薄层板点样位置，所有点居中，边缘位置不点样，再次实验同板重复性点样方法如图6所示，扫描结果如图7所示。

 

 

图6  修正后同板重复性点样方法

 

 

图7  修正后同板重复性扫描结果

 

七、检测结果汇总

 

经多次实验摸索，完成相应校准参数、校准条件的确认，汇总检测结果。

 

1.结果分析方法

 

(1)线性误差计算方法

 

将各斑点3次扫描的峰面积平均值，从校准曲线上求得拟合浓度cp，计算公式如式(1)   

 

 

式中:A——峰面积；——峰面积的平均值；a——校准曲线截距；b——校准曲线斜率；cp——拟合浓度，mg/mL。

    按式(2)计算标准曲线各测量点拟合浓度的线性误差。

    Δc=cp-cs    (2)

    式中:cs——标准溶液的浓度，mg/mL；Δc——拟合浓度的线性误差，mg/mL。

    线性误差实验数据汇总如表3所示。    

 

 

表3  线性误差实验数据汇总表

 

    (2)同点重复性计算方法

    同点7次扫描图谱的比移值和峰面积按式(3)分别计算。    

 

 

    式中:n——重复测量次数(n=7)；Ai——第i次测量比移值或峰面积的测量值；图片——n次重复测量比移值或峰面积的平均值。

(3)同板重复性计算方法

 

根据同板重复性7次平行样的峰面积，按式(3)计算相对标准偏差，即为同板峰面积重复性。实验结果如表4所示。

 

 

表4  重复性误差实验数据汇总表

 

八、结果表征

 

通过我公司计量、质检团队的努力，完成了带自动点样仪的薄层色谱扫描仪校准方法攻关，验证落实了详细的检测方案、校准参数，确认了校准方法的可实施性，该方法攻关取得了成功。

 

九、讨论

 

目前随着药品质量监管形势越来越严格，实验室仪器的校准合规性要求越来越高。在新颁布的国家校准规范普及前，药品生产企业为保障仪器检测结果的溯源性，需不断探索应用新方法，把好药品检测的质量关。

 

通过本次方法攻关，我公司攻关团队明确了JJF1712-2018未进行规定的展开剂配方、薄层板类型等关键参数的摸索，顺利完成了自校准方法的开发，为上级法定计量检测机构的建标工作提供了可参考的实验依据。