在靶向激酶的抗肿瘤药物研发领域中，变构调节剂的开发格外引人关注。根据作用方式和结合位置可将激酶抑制剂分成 6 大类型，III型和 IV 型均通过非底物结合位点对激酶活性发挥调控作用，即变构调节。除了更易于成就高选择性外，激酶变构抑制剂开发还在如下方面具有优势：

 靶点蛋白具有正常生理功能，正构抑制的策略不适用（如离子通道）

靶点正构位点存在天然底物，较高的给药剂量给用药安全带来挑战

克服正构结合口袋内氨基酸突变造成的耐药问题，且实现突破瘤种限制

01变构激酶抑制剂开发难点

变构类药物研究实质上是对正构结合位点—变构结合位点—两者间动态信息传播机制三者构成的系统的研究，设计中存在诸多挑战巨大的环节：

 1．Hits 发现与优化的困难

早期的变构抑制剂均发现于偶然，如靶向 MEK，Akt 以及 Bcr-Abl 的变构抑制剂最初均来源于基于生化指标或细胞表型的高通量筛选，同时变构抑制剂 Hits 分子蛋白活性往往较差，对于高通量筛选的灵敏度有较高要求，整体开发效率低；变构口袋以及小分子的结合模式获取困难，难以通过基于结构的合理设计指导分子优化。同时，已报道的变构抑制剂数量少，基于配体的药效团模型等亦难以发挥作用。且变构抑制剂发挥作用依赖于对靶蛋白构象的改变，小分子对变构口袋亲和力的增加无法与其活性直接对应，对其活性优化提出巨大挑战。

2．活性评估困难

变构剂发挥作用依赖于对靶点蛋白构象的改变，小分子对变构口袋亲和力的增加无法与其生物活性相对应。因此变构抑制剂的活性评估难以通过底物竞争性实验准确评估，更多需要结合表型筛选。

3．“合适”变构口袋的发现困难

一些变构口袋虽然能够引起蛋白的结构改变，或是干扰与靶蛋白相关的蛋白-蛋白（或肽/配体）相互作用，但对其本身激酶催化功能影响甚微，针对这些变构位点开发抑制剂或许难以完全抑制激酶信号通路，从而影响其药效。

02针对变构剂开发的应对策略

1．应对Hits发现和优化的挑战

高通量筛选中使用高浓度 ATP 筛选条件剔除 ATP 依赖型竞争性抑制剂，富集潜在的变构抑制剂

使用筛选通量更大的 DNA 编码化合物库（DEL）应用于变构抑制剂的筛选

使用表面等离子共振（SPR）和亲和选择质谱（ASMS）等生物物理方法

基于片段的筛选（FBDD）与 SPR、NMR 或 X- 射线晶体等手段相结合

NMR 或 X- 射线晶体等手段对变构口袋&结合模式的确定指导分子优化

2．应对变构口袋和结合位点识别的挑战

随着越来越多蛋白质变构共晶结构的解析以及算法算力的不断提升，基于机器学习、分子动力学模拟等计算方法在蛋白质结构预测以及变构口袋确定、小分子结合模式预测以及变构机理研究中发挥着越来越大的作用，为变构抑制剂的“理性设计”提供了强有力的工具。继“高选择性激酶抑制剂药物发现与分子动力学模拟”一文，介绍了分子动力学模拟在捕捉蛋白动态构象变化中的应用后，此次将展开介绍其在变构结合口袋发现中的关键作用。

03针对难成药靶点变构剂的研发体会

1．动力学模拟在PI3Kα变构抑制剂开发中的应用

Alpelisib 作为首个上市的专门针对 ER+/HER2-晚期乳腺癌 PIK3CA 突变患者的治疗药物，设计上利用了正构口袋的差异残基 Gln859 实现了亚型选择性，但对PI3Kα 的突变型与野生型却不具选择性，因而存在高血糖、肝毒性和严重的肺炎等副作用。目前，PDB 数据库里已公开了多个 PI3Kα 的晶体结构，但静态结构均不能反映分子在生理条件下沿着不同构象相互转换的过程，因此也无法就未知变构口袋的识别提供有效的信息。蛋白质变构为解决上述问题提供了新的机遇。变构剂作用于变构位点，不直接与作用于正构位点的内源性配体竞争，确保了维持靶点正常生理功能的同时，有效达到调控的目的。此外，相对于高度保守的正构位点，更多样化的变构位点赋予了变构调节剂潜在的高选择性和低毒性。

通过晶泰科技自主研发的 AI 算法、分子动力学模拟技术及加速增强采样技术XPose，我们对突变型蛋白和具有一定选择性的探针分子进行了长时间的动力学模拟，观察到探针分子对 PI3Kα 突变型蛋白中的关键结构的变构调控，发现了与正构位点的协同变构的关键氨基酸残基；结合实验研究，定位并验证了具有一定体积的变构口袋；在此基础上揭示了变构抑制剂发挥活性抑制作用可能的分子机制。这表明，结合实验与晶泰科技自主研发的计算方法可以作为强有力的工具来促进变构、泛突变体（H1047X、E542X 和 E545X）和异构体选择性 PI3Kα 抑制剂的发现。

蛋白靶点未结合配体时的晶体结构显示为灰色，经动力学模拟变构后的结构显示为浅紫色。

红色与深紫色区域分别为变构前和经小分子（浅紫色串球代替）诱导变构后的关键氨基酸区域。

黄色圈为变构口袋，红色圈为正构结合口袋。

由以上结果可见，晶泰科技动力学模拟技术在变构位点发现及新型变构剂研发中，具有技术优势且准确性得到验证。