质谱技术是抗体药物分析最重要的技术手段之一。本文简述了抗体药物的发展和质谱技术的原理。对于质谱技术在抗体药物的分析中应用进行了归类整理，主要分为在一级结构和高级结构分析中的应用。

抗体类药物是指含有抗体片段的蛋白类药物，所以在恶性肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、感染和器官移植排斥等重大疾病上得到了快速的发展，是当前生物药物领域增长最快的一类药物。

01  抗体药物发展新趋势

在生物药物领域，抗体药物占据着越来越重要的地位，全球销售排名前10位的药物中有6个为抗体药物，抗体药物按来源分类可以分为：鼠源单克隆抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。目前，批准的单克隆抗体药物中，人源化单抗和全人源单抗数量已占据大多数。

（1）抗体药物偶联物（ADC）

抗体药物偶联物（ADC）由单克隆抗体和小分子化合物两部分组成。通过抗体的靶向作用，ADC 的抗体部分和肿瘤细胞表面抗原特异性识别并结合，通过细胞内吞作用，将抗体和小分子化合物一起带进肿瘤细胞内部，释放出小分子化合物。这样既可以降低小分子药物的毒性，同时具有靶向结合的作用。已经上市的两个ADC 是Kadyla 和Adcetris。

（2）双特异性抗体（BsAb）

双特异性抗体（BsAb）是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，由于基因工程的发展，目前双特异性抗体已经研发出多种类型，主要类型有三功能双特异性抗体、IgG-scFv、三价双特异性分子、串联单链抗体（串联scFv）、DVD-Ig 等多种形式。

蛋白质多肽药物，是一些分子量从几千Da到十几万Da的生物大分子。与传统的化药分子相比，生物药分子有着非常复杂的高级结构，这些高级结构直接和生物药分子的功能相关。基于HDX技术研究蛋白质结构并不是一个新的研究领域，该技术理念早就上20世纪50年代就已提出。目前HDX-MS技术俨然已成为生物化学家探索蛋白质的结构、动力学和功能的重要工具之一。检测骨架氢转换率最早的方法是用氚代和浓度梯度柱，直到80~90年代期间才逐渐被氘代和核磁共振（NMR）技术替代。由于HDX-MS在进样和数据分析方面更加自动化，该技术逐渐成为研究蛋白质生物药领域中的新宠，尤其是在抗原表位分析和质量控制方面。

图1 生物药分子的高级结构

图2 不同生物药制剂的高级结构对比

02  高级结构分析

蛋白质、核酸类分子的高级结构分析技术，早在上个世纪50年代，就为人类认识生命的奥秘做出了重大的贡献。发展到今天，生物医药领域可以使用为数众多的现代分析技术，对生物药的高级结构进行各种层次的分析：X-ray 衍射、核磁共振、冷冻电镜、HDX、CD 和 FTIR 等。

03  实验原理

HDX（氢氘交换）是一项广泛的应用在溶液状态中蛋白质多肽分子结构的技术。其主要原理是，在溶液中蛋白质分子骨架的氢原子和溶液中的氘的交换。在表面的骨架氢原子和氢键作用力弱的氢，交换的速度快；在内部结构的骨架氢和氢键作用力强的氢原子，交换速率慢。使用质谱仪，对氘代后的蛋白质分子进行分析，可以获得氘代的比例和位置信息。

图3 氢氘交换过程

EXPERT OPINION ON DRUG DISCOVERY, 2017 VOL. 12, NO. 10, 981-994

04  实验步骤

APT推出的HDX服务基本实验步骤如下：

蛋白质药物置于中性溶液，非变性条件下 ➡ 加入抗原等结合分子（可选） ➡  加入氘代缓冲液 ➡ 氘代若干时间点 ➡ 终止反应 ➡ 在线酶解（pepsin） ➡ LCMSMS分析 ➡ 软件处理数据 ➡ 数据作图 ➡ 正式报告

图4 HDX的基本实验流程

05  高级结构的批次对比

HDX分析技术，在生物药质量研究中的多个领域都有应用，其中生物药生产中批次对比（或者生物仿制药的原研对比）是较为直接的一种。通过对不同批次或者不同生产厂商的相同序列生物药大分子的HDX分析，对数据进行软件解析后，能够获得氨基酸序列级别的分析能力。图4是一个多批次的单抗样品的HDX比对图（蝴蝶图），从图中可以获得关于按照序列分析的氨基酸残基位点的氘代交换程度。

图5 HDX批次分析

06  抗原表位分析

中科新生命提供的HDX分析服务，使用高分辨质谱（QE）采集数据。可以在蛋白质样品预处理时，加入抗原，后续进行抗原表位析，确定抗原抗体结合位点。在这类数据分析中，解析的是抗原分子的氘代程度，而非抗体。抗原表位分析对于生物药的前期开发非常重要。

图6  抗原表位分析（HDX）

除了上述数据，HDX分析数据的展示还有多重形式。图7是氘代程度的统计学分析（必须至少重复三次）；图8 是氘代后的肽段覆盖率数据展示。