摘  要 / Abstract

 

发酵类中药历史悠久，但目前对其研究尚不够深入，质量控制标准有待完善提高。本文对发酵类中药的物质基础研究、分类、质量控制现状进行了综述，旨在阐明目前发酵类中药质量控制中存在的问题，为后续质量控制和标准的提高提供参考。

Fermented traditional Chinese medicine (TCM) has a long history,but research in this field is not sufficient and the quality control standards need to be improved.This article reviews studies on the material basis,classification and quality control status of fermented TCM,aiming to clarify current problems in the quality control of fermented TCM,and provide insights for further improving quality control standards.

 

 

 

关 键 词 / Key words

 

发酵；中药；质量控制；研究进展

fermentation; traditional Chinese medicine; quality control; research progress

 

中药发酵属于炮制方法的一种，是指取待炮制品加规定的辅料拌匀后，制成一定形状，置适宜的湿度和温度下，使微生物生长至其中酶含量达到规定程度，晒干或低温干燥[1]。中药的发酵炮制方法始见于《神农本草经》。

 

发酵类中药既可以直接作为饮片用于临床，也可以作为众多中成药的原料或处方组成，其真伪优劣直接影响临床效果。发酵类中药应用广泛，种类繁多，但由于各地处方及发酵工艺不统一、缺少发酵类中药质量的评价方法，导致发酵类中药产品质量参差不齐。本文对发酵类中药物质基础研究、分类、质量控制现状进行了综述，阐述发酵类中药现存问题，以期为该类产品质量控制研究提供参考。

 

01  物质基础研究

 

发酵类中药可能是通过转化的化学成份、菌种代谢产物等发挥作用，针对这些物质基础已有许多相关报道。

 

1.1 消化酶

 

发酵时空气中的水分子是微生物生长的温床，在其发挥催化作用的过程中会产生大量的消化酶。消化酶种类繁多，有纤维素酶系、蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、脂肪酶等。目前在发酵类中药研究中，对消化酶的研究较多。整理常见发酵类中药产生酶的种类，如表1所示。

 

 

1.2 化学成份转化降解

 

1.2.1 低聚糖

 

发酵类中药的低聚糖来源有2条途径。途径1：对于米面为基质的曲类，发酵过程中会产生淀粉酶、糖化酶等消化酶，酶作用于底物产生葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖等低聚糖。途径2：在发酵过程中，原药材中某些糖苷类成份被降解，失去糖配基。张超[12]采用苯酚-硫铵法测定不同发酵时间的半夏曲中总多糖含量，结果显示，含量先增加后减少，原因是发酵初期大分子物质被产生的酶逐步酶解成低聚糖，后期微生物消耗产生的糖。刘洋等[13]、Magrini等[14]采用复合益生菌分别对王不留行、益母草、黄芪进行发酵，测定多糖含量，结果显示，多糖含量均增加。

 

1.2.2 脂肪酸

 

当发酵类中药的原药材含有较多的油脂及不溶性酯类时，产物会包含长链脂肪酸及小分子酸性物质，如六神曲发酵后酸度增加[15]、半夏曲中甘草次酸含量会随发酵而升高[16]等。但对于酸类物质的具体来源及机制暂无明确的研究阐述，仅有结论，后续可作为研究方向。

 

1.2.3 活性成份转化

 

林王敏等[17]、王丽芳等[18]、杜晨晖等[19]分别对淡豆豉、六神曲、酸枣仁发酵前后成份转化进行研究，结果显示，均存在黄酮苷类物质脱糖基转化为苷元的现象，发酵后苷元含量上升，为发酵类中药成份寻找质量控制指标提供了参考思路。另外，可以利用微生物将苷转化为苷元这一作用，人工制备不易得到的苷元，如王永宏[20]通过微生物发酵法实现了栀子中有效成份栀子苷元京尼平的制备。

 

除苷向苷元转化外，还可利用发酵提高其他种类有效成份的转化。如甘草发酵后甘草酸转化为甘草次酸[21]、黄芪经保加利亚乳杆菌发酵后总黄酮和总皂苷含量增加[22]、将人参中含量较高的人参皂苷Rb1转化为生物活性更高的稀有人参皂苷C-K[23]等。因此，发酵可作为辅助中药提取、提高中药有效成份利用率的有效方法。

 

1.2.4 有毒物质降解

 

发酵作为炮制技术的一种，具有增效减毒的作用。发酵类中药化风丹中生物碱类成份既是指标成份也是毒性成份。马奋刚等[24]测定发酵前后化风丹中次乌头碱、乌头碱、新乌头碱3种双酯型生物碱及苯甲酰新乌头碱、苯甲酰乌头碱、苯甲酰次乌头碱3种单酯型生物碱的含量，结果表明，发酵后毒性较大的双酯型生物碱含量下降，而单酯型生物碱含量上升，提示可能存在2种生物碱间的转化。朱舟等[25]利用天南星与白僵菌双向发酵得到抗惊厥药效不变、半数致死量(LD50)增大2倍、毒性较小的产物，达到减毒的目的。

 

1.3 菌种变化

 

微生物是发酵炮制的核心，发酵过程中微生物的种类、数量、优势菌种等均处在动态变化中，对于发酵过程中菌种变化的监测有利于筛选优势菌并进行分离鉴定，为后期实现纯种菌发酵及质量控制提供理论基础。朱海针等[26]、龙凯等[27]、陈彦琳等[28]分别采用Biolog微生物自动鉴定系统、聚合酶链式反应(PCR)技术、基因测序技术动态监测不同发酵时间点淡豆豉、半夏曲、六神曲中微生物种类的变化，总结菌种变化的规律并确定优势菌种，为后续该类中药实现纯种菌发酵提供参考。

 

上述对于微生物的鉴定均采用传统分离和高通量测序技术，该方法前期处理耗时较长且鉴定结果需人工整理，无法直观给出。目前，随着分析技术的不断发展，质谱技术以其灵敏度、准确度高且能进行结构鉴定等优点应用日益广泛，在微生物鉴定领域，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、敞开式离子化质谱(AI-MS)技术以其分析时间短、检测成本低、信息直观、易于操作等优点逐渐成为微生物检测的重要方式[29-32]。但目前未见该技术应用于发酵类中药的微生物群落鉴定，可作为日后研究的方向。

 

1.4 真菌毒素

 

真菌毒素是由真菌产生的次级代谢产物，主要包括霉菌毒素和蕈菌毒素，易产生致癌、致突变作用。为避免真菌毒素对用药安全的影响，应严格检测和控制真菌毒素的含量，发酵类中药更应注重该安全性指标的控制。李汶等[33]、张雪辉等[34]分别采用酶联免疫吸附测定法、高效液相色谱法与荧光光度法检测常见中药淡豆豉、生建曲、六神曲及含有六神曲的中成药保和片、含有淡豆豉的中成药银翘解毒片中黄曲霉毒素含量，结果显示，药材中黄曲霉毒素B1含量差距较大，提示发酵类中药有可能被黄曲霉毒素污染，应加强检测。另外，发酵类产品不应只关注黄曲霉毒素，如赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、肉毒毒素等作为常见的真菌毒素，在发酵类中药中却鲜有报道[35-37]。

 

02  发酵类中药的分类

 

2.1 按发酵方式分类

 

按发酵方式分为传统自然发酵和现代纯种菌发酵。传统自然发酵是指在适宜温湿度条件下，借助空气中存在的菌种发泡或产生霉衣。目前，对传统自然发酵中“适宜”二字的定义并不具体，但发酵顺利与否受温湿度条件影响较大。同时，传统自然发酵终点的辨别仍需人工经验辅助，掺杂了主观臆断的可能。另外，参与传统自然发酵的微生物种类和数量存在较大的不确定性。以上因素均不利于统一的质量控制。随着现代分析技术的发展，微生物的分离鉴定越来越普遍，这使优势菌种的选择和纯种菌发酵成为可能。现代纯种菌发酵严格控制发酵温湿度、参与催化分解作用的微生物种类和数量等，从发酵原药材的挑选、菌种的选择、发酵环境的优化等方面保证发酵过程的动态控制[38]。与传统自然发酵相比，现代纯种菌发酵能够更好地进行质量控制，但目前市场上大多数发酵类中药仍采用传统自然发酵方式。

 

2.2 按发酵技术手段分类

 

2.2.1 固态发酵

 

固态发酵是指在固态的营养基质上进行微生物发酵的过程，基质中几乎无自由流动的水，起源于古代炮制技术中的制曲工艺，包括药材预处理、微生物选择、发酵参数优化等步骤[39]。该发酵技术操作简便、设备和场地要求较低，但发酵环境处于开放状态、发酵终点的确定依赖经验、参与发酵的菌种不固定且未对基质进行灭菌[40]，导致成品存在批间差异，市场上流通的产品质量参差不齐。六神曲、建曲、半夏曲、淡豆豉、百药煎等均属于固体发酵。

 

2.2.2 液体发酵

 

液体发酵是在融合了抗生素制备工艺的基础上发展起来的，将优势菌种的菌丝接种在培养基上，发酵产物为菌丝体和次级代谢产物。该发酵技术解决了固体发酵中混合菌株开放式发酵的问题，可实现大规模生产，提高生产效率，成为发酵类中药大生产的主要方式。如利用真菌糙皮侧耳制备的党参发酵液镇痛效果显著提高[41]、积雪草经黑曲霉JH-2菌株液体发酵后积雪草酸质量分数提高3倍[42]等。

 

2.2.3 双向发酵

 

双向发酵技术起源于固态发酵，区别在于将固态发酵中农副产品等营养基质以具有一定活性成份的药材或药渣替代，并接种优选菌种进行发酵的制备手段[43]。如利用毛霉、曲霉、青霉等微生物转化人参皂苷、葛根素、黄芩苷等[44]。双向发酵技术实现了中药的二次利用，增加了中药有效成份的利用率，提高药效，目前研究广泛[45-46]，常见的红曲为该类发酵技术所得。

 

2.3 按发酵基质分类

 

2.3.1 米面曲类

 

米面曲类中药是以米面等营养物质为基质进行发酵的产物。作为发酵类中药中最为常见的曲类，最早的记载可追溯到商周时期的《礼记》。以曲类形式入药，最早见于东汉张仲景所撰《金匮要略》中的 “薯蓣丸”[47]。

 

目前，常见的米面曲类有六神曲、建曲、半夏曲、红曲、沉香曲、采云曲等。其中，临床需求量排名前三的分别为红曲、建曲和六神曲[48]。米面曲类处方差异较大，有几味药材组成的如六神曲，也有几十味药材组成的如漳州神曲。由于米面曲类处方组成各地差异较大、生产工艺处于半工业化阶段等原因，质量控制仍处于起步阶段，市场上以次充好的质量问题大肆泛滥，长此以往，临床需求萎缩、曲类中药发展受阻等问题将不断呈现。因此，统一米面曲类中药的处方配比、规范生产工艺、制定质量控制方法、形成完善的质量标准迫在眉睫。

 

2.3.2 胆汁发酵类

 

胆汁发酵类中药是以来源于猪、牛、羊、鸡等的胆汁为基质、具有药效的中药为底物进行双向发酵的产物，常见的有胆南星、体外培育牛黄、化风丹、胆黄连等[49-50]。其中，胆南星已作为发酵加工品收录于《中国药典》2020年版一部。目前，胆汁发酵类中药的发展受制于胆汁来源不同，发酵工艺各异，发酵时间少则几天多达数月，性状的描述多为气微腥味苦，受人为经验影响等因素。未来需继续发掘适用于胆汁发酵的药材、对胆汁来源进行说明、规范发酵工艺，实现工业化大生产。

 

2.3.3其他类

 

除以米面等营养物质或胆汁作为发酵基质外，还有直接使用药材不外加基质进行发酵的中药，如淡豆豉、百药煎、青黛、冬虫夏草菌粉等。其中，淡豆豉已作为发酵加工品收录于《中国药典》2020年版一部，质量控制方法较为成熟。

 

03  质量控制现状

 

查阅《中国药典》、部颁标准、各省中药饮片炮制规范中发酵类中药的收录情况可以发现，目前该类中药仍多以性状鉴别为主，大部分无统一的处方及工艺规范，缺乏量化的、体现药效的、具有发酵类中药特色的质控指标，质量控制技术手段和质量标准处于不成熟阶段。本文将从以下2个方面对发酵类中药的质量控制现状进行综述。

 

3.1 处方及工艺

 

处方比例和发酵工艺的不同，将会影响发酵类中药的临床疗效。整理不同标准中常见发酵类中药的处方及工艺，如表2所示。

 

 

 

 

3.2 质量控制方法

 

对于发酵类中药，目前的质量控制方法主要包括性状、鉴别、检查等，如表3所示。

 

 

 

 

除《中国药典》、部颁标准、各省中药饮片炮制规范中有对发酵类中药具体成份进行含量测定外，现代研究认为，消化酶是能反映发酵类中药质量的指标[51-53]。目前，针对发酵类中药酶活力测定方法按照原理主要分为2类：测定底物的消耗量和测定酶解产物的量。常用的方法有碘淀粉比色法、3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法、福林酚法、对-硝基苯磷酸盐(pNPP)法、对-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)法、纤维蛋白平板法等。现将有关报道汇总如表4所示。

 

 

 

04  总    结

 

4.1 统一处方组成，优化规范生产工艺

 

目前，发酵类中药国家标准相对滞后，地方标准较多，且各地标准处方组成或配比不同、发酵方式及工艺参数不统一、质量控制技术和方法落后，直接影响了产品的质量和安全控制。其中，处方组成项中涉及的发酵用辅料尚无统一的来源及规格规定，如胆汁、黄酒、面粉等，应予以明确并制定质控标准。

 

另外，发酵类中药在大生产中仍多采用固体发酵及传统自然发酵的方式，而涉及优势菌种、提高有效成份转化、提高生产效率的液体发酵和双向发酵技术仅停留在实验室成果阶段，并未规模化转化应用。因此，后续应关注优势菌种的筛选及高效发酵技术手段和生产工艺的开发应用。

 

4.2 开展发酵过程及物质基础研究

 

除了配方本身的物质基础，发酵类中药由于微生物的参与，会具有产生消化酶及次生代谢产物、原成份发生转化降解、优势菌种逐渐显现并且引入真菌毒素对用药安全性产生威胁等特点。目前对发酵类中药消化酶的研究较多，但对于微生物次生代谢产物及化学成份转化的研究不够深入，应加强发酵机制和物质基础等方面的深入研究。

 

4.3 开展功效机制及质量评价方法研究

 

发酵类中药虽然临床使用非常广泛，但因物质基础及作用机制研究不够深入，质量控制指标有待进一步明确，质量控制技术和方法有待进一步提高和完善。建议加强潜在质量控制指标的研究，从消化酶和化学成份两方面入手，在作用机制研究的基础上，寻找具有发酵类中药特色且真正能反映质量的控制指标。同时应关注安全性控制指标，特别对因生产过程控制不规范导致菌种变化及有毒代谢产物如真菌毒素等的控制。

 

总之，发酵类中药的研究、生产、使用和质量管控仍处于较为初级的阶段，因其历史悠久，临床价值高，发展前景必然广阔，值得进一步在做好传承的基础上，做好创新发展和利用。