摘要：

基于单克隆抗体药物的特点，分析了可能影响其临床有效性和安全性的风险因素，包括抗体的结构、靶点特性、药理作用机制、质量控制和临床拟用患者人群等。基于这些风险因素，结合审评实践和国内外监管机构发布的技术指导原则，阐述了对单克隆抗体药物设计、早期筛选及非临床研究计划的一般考虑。围绕单克隆抗体药物非临床审评的关注重点，即非临床研究结果的临床的相关性、局限性以及由非临床向临床转化时预测的不确定性进行了探讨。

正文：

1975 年，Köhler G 和Milstein C 建立的杂交瘤技术使规模化制备高特异性、均一性的单克隆抗体( 以下简称单抗) 成为可能，由此获得的单抗在疾病诊断和各种检测中发挥了巨大的作用。基于该项技术， 1979 年， Schlossman 和其同事发现了靶向T 细胞表面抗原并具有清除T 细胞单抗OKT3( muromonab-CD3) 。经过临床试验验证， 1986 年，美国FDA 批准OKT3 用于器官移植后的急性排斥，这也是FDA 批准的第一个单抗药物。但由于鼠源性抗体在人体反复使用后出现的人抗鼠抗体反应，很大程度上限制了其在临床治疗中的应用，这也导致2006 年以前仅有寥寥几个抗体产品批准上市。随着分子生物学的发展，人们已可通过抗体工程技术制备基因工程抗体，如人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体等，治疗用抗体药物已逐渐成为生物技术药物开发的热点。随着对抗体的结构和功能的深入了解，新一代更符合临床治疗需求的新型抗体药物( 如糖工程抗体、Fc 融合蛋白、抗体偶联药物、双特异抗体、抗体片段等) 不断出现，抗体治疗的疾病种类也在不断扩大。截至2015 年，FDA 仅批准了第50 种抗体药物，然而仅仅6 年多时间，2021 年4 月FDA 便批准了第100 个抗体dostarlimab，抗体类药物正式进入了“百”抗时代［1］。这些抗体类药物主要批准用于肿瘤、炎症性疾病、器官移植排斥、偏头痛和感染性疾病。据统计，治疗用抗体类药物2018 年全球销售总额约为1 152 亿美元，预计到2025 年将会达到3 000 亿美元［2］。相比发达国家，我国抗体类药物的研发起步较晚，但随着抗体类药物研发的工程技术开发、人才队伍建设以及投资规模等方面的不断发展，我国抗体类药物开发正处于快速发展的阶段，大量从事抗体类药物创新研发的公司不断涌现，抗体类药物的申报数量也在逐年增长，虽然仍存在热门靶点大量集中的现象，但差异化现象已逐渐显现。为更好地促进我国抗体类药物产业科学健康的发展，本文参考相关技术指南和专业文献，初步探讨了单抗药物风险因素，阐述了对单抗药物设计、早期筛选及非临床研究计划的一般考虑，以期为申办方、研究者以及审评人员提供参考。

一影响抗体药物有效性和安全性的因素

1．1 抗体类别、亚型、结构以及功能

1.1.1 抗体的类别和结构

抗体的基本结构是由2 个完全相同的重链( heavy chain，H) 和2 条完全相同的轻链( light chain，L) 通过二硫键连接的呈Y形的单体。根据H 链恒定区抗原性的差异又可将其分为5 类: α 链、δ 链、ε 链、γ 链和μ 链，抗体也对应被认为5 类: IgA， IgD， IgE， IgG 和IgM。按照L 链的不同，抗体又可分为κ 型和λ 型。抗体的H 链和L 链靠近N 端的氨基酸序列变化较大，形成的结构域称为可变区( variable region，V 区) ，靠近C 端的氨基酸序列相对恒定的区域称为恒定区( constant region，C 区) 。V 区的H 链和L 链分别称为VH和VL，VH和VL各有3 个互补决定区( complementaritydetermining region，CDＲ) ，可与抗原表位形成互补的空间构象。C 区的H 链和L 链分别称为CH和CL。

截至目前所有批准的治疗用抗体都是IgG，标准的IgG 抗体结构由2 个完全相同的抗原结合片段( Fab) 和1 个可结晶片段( Fc) 组成。其中Fab 段由L 链( 包括VL和CL结构域) 和H 链的VH和CH1 结构域组成，可特异性地与单个抗原表位结合; Fc 段是由1 对H 链的CH2，CH3 结构域组成，无抗原结合活性，但可与Fc 受体( FcＲ) 或补体成分C1q 相互作用而发挥重要的功能效应。2 个Fab 段通过柔性铰链区与Fc 段相连，这种结构可将结合的抗原与免疫系统的体液成分和细胞成分“桥联”，在识别抗原的同时，发挥Fc 段介导的功能效应［3］。

1.1.2人FcＲs 及表达特征

在人体中，与IgG 的Fc 段结合的FcＲs 共有10 种［4 － 5］，包括6 种经典的IgG FcＲs( 即FcγＲI /CD64，FcγＲIIA/CD32A，FcγＲIIB/CD32B，FcγＲIIC/CD32C，FcγＲIIIA/CD16A，FcγＲIIIB/CD16B) 、2 种非经典的FcＲs( 即FcＲn 和TＲIM21)和2 种FcＲ 样受体( 即FcＲL4 /CD307d 和FcＲL5 /CD307e) 。这些FcＲs 主要表达于免疫细胞( 包括血小板) 及一些非免疫细胞( 如内皮细胞) 表面，并且不同细胞表达的FcＲs 组合和表达水平各自不同。在血管内皮细胞和肠上皮细胞表面表达的FcＲn，参与IgG 的循环和间接转运( 从循环系统进入组织，反之亦然) ，而在胎盘母体一侧滋养层细胞表达的FcＲn，可将母体IgG 主动转运到胎儿血液中。除了运输和循环IgG 的作用外，FcＲn 还被报道运输IgG结合的抗原，促进树突状细胞、单核/巨噬细胞和中性粒细胞对抗原的递呈及随后的免疫应答。FcＲL4和FcＲL5 仅在B 细胞表达，其中FcＲL5 在多种B 细胞亚群中表达，而FcＲL4 仅在组织记忆型B 细胞中表达。TＲIM21 是一种广泛表达的细胞内受体，但在自身免疫性疾病患者的上皮细胞和胶质细胞表面也有表达。经典的FcγＲs 又可分为激活性FcＲs( 包括高亲和力的FcγＲI 和低亲和力的FcγＲIIA，FcγＲIIC，FcγＲIIIA) 和抑制性FcＲs ( FcγＲIIB) 。激活性FcＲs 可通过胞质内的免疫受体酪氨酸激活基序( immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAMs) 的磷酸化招募蛋白酪氨酸激酶( protein tyrosinekinase，PTK) 来传导激活信号，最终会导致效应细胞的激活、细胞因子/趋化因子的释放以及细胞的迁移。而抑制性FcγＲIIB 通过胞内的受体酪氨酸抑制基序( immunoreceptor tyrosine-based inhibitorymotif，ITIMs) 的磷酸化并招募蛋白酪氨酸磷酸酶( protein tyrosine phosphatase，PTP) 从而达到抑制和平衡PTK 参与的激活信号通路。FcγＲI 在单核/巨噬细胞以及一些树突状细胞中组成性地表达，在炎症状态下在中性粒细胞和肥大细胞表面也可诱导表达。FcγＲIIA 在所有的髓样细胞以及血小板表面表达，在淋巴细胞表面无表达。FcγＲIIB 在B 细胞和嗜碱性粒细胞表面高表达，在单核细胞、组织巨噬细胞和树突状细胞表面也有表达。FcγＲIIC 仅在携带FCGＲ2C-OＲF 等位基因的个体( 约占人群的20% ～25%) NK 细胞、单核细胞和中性粒细胞表达。FcγＲIIIA 仅在NK 细胞和单核/巨噬细胞表面表达。FcγＲIIIB 仅在中性粒细胞有较高表达，在碱性粒细胞也有少量表达。FcＲs 所触发的细胞反应不仅取决于其细胞表面的表达水平和传递信号的能力，还取决于其结合的配体。研究显示，免疫球蛋白( immunoglobulin，Ig) 与FcＲs 相互作用的亲和常数( KA)范围为2 × 104 M－ 1 ～ 1 × 1010 M－ 1，可区分为高亲和力FcＲs 和低亲和力的FcＲs，高亲和力的FcＲs 可与游离/单价Ig 结合，而低亲和力的FcＲs 只能与免疫复合物、聚合体或调理形式的Ig 结合［3 － 7］。

1.1.3抗体Fc 段介导的功能效应

Fc 段介导的功能效应包括［4 － 5］:

① Fc 介导的细胞激活，Fc 可与激活性FcγＲs 结合，直接激活表达FcγＲs 的免疫细胞( 如NK 细胞、血小板、巨噬细胞等) ，进而导致细胞因子释放、激活相关的凋亡，以及主要由NK 细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用( antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC) 和由巨噬细胞和粒细胞介导的抗体依赖性细胞介导的吞噬作用( antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP) ;对于某些共刺激分子( 如4-1BB，CD40 等) 激动型单抗，Fc 与FcγIIB 结合后可诱导靶细胞表面的靶抗原聚集，进而导致靶细胞激活和细胞因子释放［8］。Fc介导的补体激活和补体依赖性细胞毒作用( complementdependent cytotoxicity，CDC) ，2 个以上的抗体Fc 段与C1q 结合后，可导致C1q 发生构型改变，通过经典途径激活补体系统，最终在靶细胞表面形成攻膜复合物( membrane attack complex，MAC) ，MAC插入靶细胞细胞膜，形成渗漏斑或亲水性孔道，进而导致靶细胞裂解。

② Fc 介导的细胞因子释放，ADCC 和CDC 介导的靶细胞( 如肿瘤细胞) 杀伤作用可导致细胞因子释放( 包括肿瘤裂解综合征) ; 而补体激活过程中形成的过敏毒素C3a 和C5a 又可与免疫细胞( 如粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞) 表面的C3aＲ 和C5aＲ 结合，进而导致这些免疫细胞的激活、驱化、ADCP 和细胞因子释放。

1.1.4人IgG 亚型与FcＲs 亲和力和Fc 功能活性

人IgGs 又可分为IgG1 ～ IgG4 这4 种亚型，由于Fc 段的不同，不同的IgG 亚型与不同的FcＲs 或C1q 有不同的亲和活性，这导致不同亚型的IgGs 体外和体内功能活性有明显不同。IgG1 可与除FcＲL4 之外的所有的IgG FcＲs 结合; IgG2 可与FcγＲI，FcγＲIIB 和FcＲL4 以外的IgG FcＲs 结合; IgG3 可与所有IgGFcＲs 结合; IgG4 可与FcγＲIIIB 以外的所有IgGFcＲs 结合。IgG1 是治疗性单抗最常采用的亚型，可与激活性和抑制性的FcγＲs 结合，能够诱导ADCC，ADCP 和CDC; IgG2 的铰链区相对较短，上铰链区含有额外的半胱氨酸残基形成的二硫键可影响IgG2的空间构象和功能， IgG2 与FcγＲs( 尤其与FcγＲI)的相互作用比IgG1 弱，但IgG2 仍可通过FcγＲIIA引发单核细胞介导的ADCC 以及巨噬细胞介导的ADCP 作用。IgG3 与FcγＲs 的相互作用较强，可引发ADCC，ADCP 作用，并且引发CDC 的作用优于IgG1，但IgG3 的铰链区较长( 难以制备和生产) ，其核心铰链区有11 对二硫键，因此对蛋白酶切割不稳定，半衰期也较其他亚型相对较短( 可能与FcＲn 的亲和力有关) ，目前尚没有批准的IgG3 亚型的单抗。IgG4 的上铰链区较短，除与高亲和力的FcγＲI 有相互作用外，与其余FcγＲs 的相互作用较弱，不会引发CDC 和NK 细胞介导的ADCC 作用，但可引发ADCP作用。在体内， IgG4 分子会经历Fab-arm 交换，从而形成半分子以及双特异功能单价抗体［3，5，9］。

1.1.5 候选抗体的设计及工程化改造

由于不同的IgG 亚型的铰链区及Fc 功能效应各有不同，在设计和筛选候选单抗时，研究者可结合靶点表达分布情况和拟定作用机制，平衡获益和风险，选择合适的IgG 亚型或Fc 结构。如果Fc 介导的功能效应对有效性并无任何贡献( 如靶向可溶性靶点或阻断细胞表面受体信号传导的单抗) ，反而出现不期望的风险时，研究者可能会选择Fc 功能效应较低的IgG4或采用工程改造使Fc 功能效应沉默。例如: 已批准上市的PD-1 单抗药物( nivolumab 和pembrolizumab)就采用了功能活性较弱的IgG4［10］，以降低对T 细胞清除作用。相反，如果Fc 介导的功能效应对有效性至关重要( 如利用ADCC，CDC 作用以清除靶细胞) ，这时就需要保留Fc 功能效应。但这有可能会带来安全性风险，例如: 在非靶细胞表面也有较高水平的靶抗原表达时，可能会导致这些细胞/组织的损伤。靶向CD40L 的单抗与血小板表面的FcγＲIIA结合，可能导致血小板激活和血小板减少症［11］。在考虑是否保留Fc 功能效应或是否进行工程化改造以增加或降低Fc 功能效应时，应平衡风险和获益，考虑的因素包括: 

① 靶抗原在靶细胞和其他正常/效应细胞中的表达水平是否存在明显差异。

② 是否可以对Fc 段进行改造，使其保留与有效性相关的FcγＲ 相互作用位点，从而使与风险相关的FcγＲ 相互作用位点突变沉默。例如: 靶向免疫激活受体( 如CD40，4-1BB) 的激动型抗体，就需要消除IgG1与激活型FcＲs( 包括FcγＲI，FcγＲIIA，FcγＲIIIA) 的结合活性，保留甚至增强IgG1 或IgG4 与抑制性受体FcγIIB 的亲和力［10］。随着结构生物学研究的不断进展，研究者对影响抗体功能的关键结构( 相互作用界面和糖基化位点及糖型) 的认识越来越充分，例如: 添加岩藻糖可降低单抗与自然杀伤细胞和巨噬细胞上表达的FcγＲIIIa 的亲和力，降低ADCC 作用; 添加半乳糖可增强CDC 作用; 唾液酸化在增加肝细胞对单抗摄取的同时还可降低ADCC 作用［12］。为满足不同的临床需求或竞争差异化的需求，基于结构生物学和拟定作用机制的工程改造抗体也越来越多［8］，例如:用于湿性年龄相关性黄斑变性的玻璃体注射药物雷

珠单抗( ranibizumab，Fab 片段) 和brolucizumab( 单链抗体片段) ，通过改变抗体的分子大小，提高了组织渗透力; 抗CD20 抗体obinutuzumab 和抗CCＲ4 单抗mogamulizumab，通过去除Fc 段盐藻糖修饰增强了ADCC 活性; 第2 代抗CD20 抗体ocaratuzumab通过Fc 段氨基酸替换增强了Fc 与FcγＲIIIA( 包括158V 和158F) 的亲和力及ADCC 活性; 抗C5抗体eculizumab 通过跨亚型Fc 段整合( 具有IgG2的118 ～ 260 氨基酸和IgG4 的261 ～ 447 氨基酸)降低了Fc 功能效应，PD-L1 单抗atezolizuamb 通过突变糖基化位点( N298A) 去除糖基化消除了Fc 功能效应。这些药物的成功上市，均说明了单抗药物结构设计的重要性。

1．2 药理作用机制及靶点特性

抗体一般通过3 种机制发挥作用，即作为拮抗剂、激动剂、通过动员具有细胞杀伤功能的先天免疫成分的细胞毒性反应发挥调理作用或促进细胞表面受体内化和降解。作为阻断剂可阻断配/受体的相互作用; 而激动型单抗则是模仿配/受体的相互作用从而启动有助于清除病原体细胞的信号级联反应。具有调理作用的单抗，可通过其抗原结合部位与靶点结合，通过其Fc 段激活补体或与先天免疫细胞表面的FcγＲs 结合，通过CDC，ADCC 或ADCP 发挥细胞毒性杀伤/吞噬作用。一般抗体会通过以上多种机制组合发挥作用。

选择合适的靶点是开发抗体药物时需要慎重考虑的重要一环，除拟用药理作用机制外，还应充分考虑靶蛋白的生物学功能和表达特征，包括: 

① 靶蛋白属于分泌性介质还是细胞表面受体; 对于细胞表面受体，还需考虑其在哪些类型的细胞或在何种细胞状态( 免疫激活/免疫耗竭) 下表达，表达丰度如何，是否可以脱落或内化［13］。

② 靶蛋白是否存在基因多态性或剪接变体，是否与其他蛋白或自身形成二聚体或多聚体。

③ 靶蛋白的生物学功能，基于文献或数据库对靶点的生物学功能/作用( 包括非期望的药理学作用) 以及下游的信号通路( 包括与其结合的配体和受体) 进行全面的分析。这些信息可能来自基因敲除/转基因小鼠模型或其他动物模型的相关研究信息，也可能来自同靶点药物的已有临床/非临床研究信息，或者存在靶点自发突变的相关人群的研究信息。若靶点涉及多条信号通路、生物级联效应或细胞因子释放，当可能导致某一无法被生理反馈机制完全控制的生物放大效应时，应引起高度关注。

④ 靶蛋白在患者和正常人、疾病组织/微环境和正常组织/微环境中的表达差异，例如:对于拟通过细胞毒性杀伤作用治疗肿瘤的单抗，理想的靶点应该是仅在肿瘤细胞表面表达而在正常细胞中无明显表达的肿瘤特异性抗原。

1．3 质量控制水平

相比小分子药物，单抗的药学质量控制水平对其安全性和/或有效性的影响更大。高分子聚合物、宿主细胞残留成分、内毒素等均可能给临床带来安全性风险［14］。产品中来自生产细胞的杂质( 尤其是先天免疫应答调节杂质，如脂多糖、β 葡聚糖、鞭毛蛋白、高迁移率族蛋白和核酸) 以及高水平的单抗聚合物( 多个IgG 分子相互靠近) 可作为危险信号促进DC 细胞的成熟、激活、蛋白胞吞和递呈，直接诱导机体产生抗宿主细胞蛋白抗体和/或抗药抗体( anti-drug antibodies，ADA) 。抗宿主细胞蛋白抗体如果能够和人体细胞产生交叉反应，则可能导致自身免疫性疾病产生。有些聚合物( 含有重复结构，能够直接与BCＲ 结合) 在没有T 细胞的帮助下也可直接激活B 细胞产生ADA( 主要为IgM) 。此外，单抗聚合物还可通过促进靶受体或FcγＲ 聚集和激活导致放大的或非期望的Fab 和/或Fc 段介导的药理学效应。单抗产品的来源也是影响免疫原性的重要因素，虽然与嵌合型、人源化或全人源的单克隆抗体

相比，鼠源抗体可引发人体强烈的免疫应答，但值得注意的是，嵌合型、人源化和全人源单克隆抗体也可引发较高发生率的免疫原性。单抗中新型序列( 如CDＲs 和其他新型序列) 、突变( 如为增加Fc 功能效应、稳定性而进行的基因突变，亲和力成熟所导致的新独特型) 、修饰( 如氧化、脱酰胺、醛基化、外源性糖型) 、新型结构( 如融合蛋白、双特异性或多特异性抗体、单链片段、单域抗体) 、连接子或连接区形成的新表位，理论上都可能被抗原递呈细胞处理和递呈给Th 细胞，帮助B 细胞形成ADA。此外，制剂中所采用的辅料( 如人血清蛋白和聚山梨醇酯) 以及容器密闭系统的材料( 包括萃取物和浸出物) 也有可能会与单抗发生相互作用进而影响产品的质量( 导致蛋白聚集、变性或形成加合物) 和免疫原性，进而导致临床风险［15］。

1．4 拟用患者人群

虽然单抗具有较高的选择性和特异性，但不同适应证或者同一适应证的不同患者对同一药物的反应往往有很大差异，这提示患者个体间的差异对有效性和安全性有很大的影响。可能影响有效性和安全性的患者个体差异因素包括: 疾病特征( 疾病类型、严重程度、靶蛋白表达水平) 、年龄( 如儿童与成人) 、遗传学( 如基因多态性、基因突变等) 、免疫学( 如免疫状态、免疫能力、预存抗体水平) 、伴随治疗( 药物相互作用) 等。

二抗体药物非临床研究策略的一般考虑

2．1 预期目标

在制定单抗的非临床研究计划时，应根据对上述可能影响产品有效性和安全性的风险因素的科学理解以及临床拟用情况( 如适应证、患者人群、拟定给药方案等) 合理设计支持性的非临床试验。这些试验获得的数据应能够满足以下评估目的: 

① 阐明毒性靶器官、毒性反应的剂量/暴露量关系以及潜在可逆性。

② 确定临床试验中需要监测的与安全性和有效性相关的指标/生物标志物。

③ 可估算人体临床试验的起始剂量、递增剂量以及临床预期治疗剂量范围。

④ 能够初步提示在拟用患者人群中预期获益大于风险。

2．2 试验项目及时间安排

与小分子药物不同，单抗由天然氨基酸组成，分子量较高，仅在细胞外液中分布，不会进入细胞质或细胞核中，不与DNA 直接发生相互作用，一般无遗传毒性风险，通常无需开展遗传毒性试验。单抗在体内可被代谢成为小肽和氨基酸，一般不会产生活性代谢产物，因此也无需开展代谢研究。单抗的靶点一般为细胞外可溶性介质或细胞表面受体，并具有较高的特异性和亲和力，因此发生脱靶毒性的可能性较小，单抗药物的毒性反应主要是放大的药理学作用。单抗与hEＲG 通道或其他离子通道的细胞外/细胞内结构域发生相互作用的可能性较低，因此一般不会对心脏的收缩功能产生明显影响，一般情况下不需要进行心血管系统体外安全药理学研究［16 － 18］。单抗所需要开展的非临床安全性试验项目可参考ICH S6 ( Ｒ1) 推荐的基本框架，非临床试验的实施时间可参考ICH M3 ( Ｒ2) 的指导意见。

2．3 临床转化思维

单抗的非临床试验一般包括采用人体/动物细胞和组织进行的体外试验以及采用相关动物种属/模型进行的体内试验，这些体外和体内试验都有助于确定单抗的药理毒理学特征。由于体外和体内、动物和人体、健康人与患者以及患者人群之间存在各种差异，如体外静态和体内动态的差异，靶点的结构、分布、表达调控和生物学功能的差异，免疫成分的结构、功能和状态的差异等，任何一项体外和体内试验都不能完全解决这种差异对临床转化的影响，各有其优缺点，在设计非临床试验时应尽可能根据试验的目的和试验影响因素对试验进行优化，以提高预测的准确性。在对这些非临床试验数据进行解释和评估时，应考虑与人体的相关性和局限性，尤其要关注向人体转化的不确定性。

三有助于风险获益评价的体外试验

由于抗体具有种属特异性，关键的体外药理活性试验( 如与靶抗原的结合活性和功能活性试验等) 应同时采用不同种属( 包括人) 的靶蛋白、细胞/组织进行评估，定量评价单抗在不同种属中的相对生物活性和敏感度，以帮助选择合适的动物种属用于进一步的体内药理学和毒理学试验，同时也有助于将动物体内试验结果外推至人体。这些体外试验可能会发现动物体内试验所不能预测的免疫毒性或可阻止临床试验开展的非预期免疫反应。在缺乏相关动物种属的情况下，这些在人体细胞/组织中进行的体外试验对预测人体有效性和安全性具有重要的价值，也是推算人体首次临床试验起始剂量的重要依据［19］。

3．1 评估Fab 功能效应的体外试验

与Fab 相关的效应包括期望的药理学作用和非期望的脱靶作用。评估Fab 功能效应的体外试验包括但不限于: 与靶抗原的亲和力试验、抗原表位表征试验( 如采用晶体衍射技术表征抗体互补位-抗原表位的空间构象) 、与天然配体的竞争结合试验( 拮抗剂应与天然配体竞争结合，而激动剂应尽可能避免与天然配体竞争结合) 、靶点占有率、细胞水平的功能活性试验( 如检测对下游信号的阻断/激动作用) 等。

3.1.1 on-target 效应

应评估候选单抗与人和不同动物种属的靶抗原/靶细胞的特异性结合作用。若可获得靶抗原的重组蛋白，可采用BIAcore，ELISA，KinExA 等方法测定体外结合力，包括解离常数( Kd) 以及结合动力学参数( Kon /Koff) 等。基于细胞结合的亲和力试验可采用流式细胞术测定EC50值。在理想情况下，如果靶点在血液细胞或其他容易采集的细胞表面表达，最好能够采用流式细胞术评估人和毒理学试验动物细胞表面天然蛋白与抗体的亲和力。此外，也可采用免疫组化( immunohistochemistry，IHC) 技术评估与人和动物组织的结合［19］。需要强调的是，抗体-抗原结合力高并不意味着更强的功能活性，靶向同一抗原的不同抗体由于结合的抗原表位不同，可能导致其功能活性有明显不同。例如: 靶向CD28 的抗体如果结合部位在天然CD86 结合部位附近，则传导共刺激信号; 但与CD28 远端位点结合的超级激动抗体即使没有组织交叉反应( tissue cross-reactivity，TCＲ) 识别的第一信号也可直接激活T 细胞［20］。因此，除评估与靶抗原的结合活性外，还应采用临床相关的体外/离体试验系统评估单抗在人和毒理学试验动物中的相对药理学活性，如对细胞的清除、抑制、激活和细胞因子生成的影响等。在进行这些试验时，应采用梯度稀释的抗体，以获得完整的剂量-反应曲线，评价指标除EC50或IC50外，还应关注Emax，尤其在与同靶点其他药物进行比较时。试验中所采用靶抗原表水平/浓度应能反映拟用患者人群中实际生理情况。由于体外刺激试验中所采用的基质( 如采用全血或PBS) 对有效浓度范围的影响较大，在试验中应进行谨慎的对比和分析［19］。除了期望的药理学作用外，还应采用这些体外试验测定候选单抗是否有非期望的免疫学作用，如阐明拮抗剂有无激动作用，受体阻断剂有无细胞清除作用等。

3.1.2 脱靶毒性

采用计算机对靶抗原和其他蛋白的序列同源性进行分析，可以初步了解候选单抗的潜在脱靶风险。对于同源性较高的蛋白或同一蛋白家族的其他成员，应测定候选抗体的脱靶结合风险。

采用IHC 技术进行的组织交叉反应TCＲ 试验除可用于表征单抗与人体组织/细胞的交叉反应性、为靶点的分布提供有用信息外，也可用于脱靶风险的筛选和评估，发现非预期的结合表位。对于单抗药物，一般采用一系列人体组织进行TCＲ 试验，这也是首次人体临床试验之前所推荐的一系列安全性评估试验之一。不推荐采用全套动物组织进行TCＲ 试验，一般仅在人体组织中发现存在交叉反应的情况下，才会采用毒理学试验所选的相关动物组织进行TCＲ 试验，这主要是为了确证毒理学试验所采用的动物组织中是否存在人体组织中类似的交叉反应性特征，评估动物试验结果与人体的相关性，解释动物试验中发现的毒性结果。需要注意的是，在抗体无法到达的区域( 如细胞质、细胞核等) 发现的阳性结合通常无临床意义。应在药理学和安全性评估的全部数据背景下对TCＲ 试验结果评价和解读。根据目前的经验，TCＲ 试验很少能够发现非预期结合反应( 脱靶风险) ，这主要是因为TCＲ 试验敏感性较差，并不能代表生理条件。在进行TCＲ 试验时，需要对多种条件进行优化，包括阳性对照组织、阴性对照组织、合适的标记物或二抗、合适的固定剂和染色程序、受试单抗的浓度范围等，此外还需要关注组织样本的质量，通常需要采用HE 染色评估组织形态，采用IHC 标志物( 如抗平滑肌肌动蛋白抗体) 评估组织样本的完好性。

由于TCＲ 试验的预测脱靶毒性的价值较低，因此业界开发了很多评估脱靶毒性的替代方法，包括人蛋白微阵列技术［21］，如Protoarry，HuProt，这种技术是采用高通量自动化的蛋白表达系统表达和纯化带有标记的人蛋白，然后将这些蛋白固定在经微细加工的微阵列表面上( 约包含10 000 ～ 15 000 多种人蛋白) ，以实现高通量地结合筛选。但这些微阵列技术的蛋白均不是采用哺乳动物细胞表达，有一定的缺点: 

① 这些蛋白缺少完整的哺乳动物细胞的糖基化模式。

② 不确定这些蛋白是否以天然构象的形式存在。

③ 当蛋白点样到玻璃载玻片上时也可能发生变性。

最近，越来越多采用人细胞阵列技术，例如: Ｒetrogenix 公司采用专有的表达载体阵列，能够在载玻片的人类细胞中分别单独过表达约5 500 多个全长人质膜蛋白和分泌蛋白，这些膜蛋白更接近天然构象，并且具有哺乳动物细胞的糖基化模式，与人体生理条件更相关，假阳性率更低。Integral Molecular 公司的人质膜蛋白阵列技术( MembraneProteome Array) 也是采用的基于细胞的结合筛选平台，建立了可表达5 300 多个全长人质膜蛋白的HEK-293T 细胞库，采用高通量的流式细胞术检测抗体与非固定细胞表达的膜蛋白的结合活性，对于筛选试验检测到的结合靶点，还可以通过梯度稀释后分析稀释结合曲线进一步确证是否属于特异性结合。由于采用流式细胞检测技术，因此该技术平台的效率和敏感性更高。不足的是这一平台技术不能检测抗体与分泌蛋白的脱靶结合作用。

3．2 评估Fc 段功能效应的体外试验

一系列的体外试验可用于评估Fc 段的功能效应，如与人FcγＲs 亲和力研究以及细胞水平的ADCC，CDC和ADCP 试验等。对Fc 功能试验的要求很大程度上取决于所选择的IgG 亚型、工程化改造目的以及拟定的作用机制。

对于ADCC 和ADCP 试验，靶细胞的选择主要取决于单抗的靶点表达情况，可采用人原代细胞，也可以采用表达靶蛋白的细胞系。对于ADCC 试验，免疫效应细胞一般为人原代NK 细胞或采用IL-2 激活、并表达高水平的FcγＲIII A 的NK 细胞系( 如NK-92 细胞) 。靶细胞诱导的NK 细胞激活可通过流式细胞术检测( 细胞激活标志物CD69 和CD107a增加) 。此外，也可以采用转染表达人FcγＲIII A 和报告基因［携带荧光素酶( luciferase) 的NFAT 启动子结构］的Jurkat 细胞来评估效应细胞的激活程度［19， 22 － 23］。除了采用报告基因法评估效应细胞的激活外，还可以采用LDH 释放法、荧光素钙染色法、CFSE 染色法或者51Cr 释放法评估对靶细胞的杀伤活性。ADCP 试验的效应细胞一般采用原代细胞( 全血或PBMC) ，也可采用表达高亲和力的FcγＲIIIA 并转染报告基因的Jurkat 细胞或体外传代的巨噬细胞，通过荧光标记的靶细胞数量下降或采用流式细胞术评估细胞绝对数量的下降来评估吞噬作用。由于在体内发挥ADCP 作用的主要是网状内皮系统，体外ADCP 试验并不能反映体内的复杂情况，因此这些体外试验只能用于定性ADCP 作用，而不能定量转化到人体。

对于CDC 作用的评估，可直接评估C1q 与Fc的亲和力。但更常用的做法是采用表达目标靶抗原的细胞系或原代细胞与人补体及不同浓度的单抗共孵育，采用ADCC 试验中类似的方法检测靶细胞的毒性。

可基于这些Fc 功能效应体外试验( ADCP 除外) ，采用最低预期生物效应剂量水平( minimum anticipatedbiological effect level，MABEL) 法计算人体起始剂量，但前提是所采用的靶细胞的靶抗原的密度/表达水平要与拟用患者人群中体内靶细胞的抗原表达水平一致/相当，这样才可以基于体外试验中EC50值计算MABEL。此外，如果在同一试验条件下，发现受试抗体引发的细胞和补体激活效应远远高于阳性对照［如阿仑单抗( alemtuzumab) 、利妥昔单抗( rituximab) ］，应需谨慎考虑，即使这些增强的反应是所期望的或者可能增加有效性。

3．3 体外细胞因子释放试验( cytokine release assay，CＲA)

首先需要明确CＲA 主要是用来发现风险/危害，而不是对人体风险进行定量评估。对于作用机制涉及细胞因子释放的单抗，CＲA 可用于作用机制研究，也可用于候选抗体的筛选［19， 24 － 25］。治疗性单抗可能通过Fab 介导的免疫细胞表面靶受体聚集/激活和/或Fc 介导的与NK 细胞、中性粒细胞FcγＲs 相互作用诱导细胞因子释放，在人体中导致形成细胞因子释放综合征( cytokine releasesyndrome，CＲS) 。这些细胞因子可能来自靶细胞，也可能来自效应细胞。在开发候选抗体药物时，应对靶点的生物学作用及作用机制的已有信息进行综合分析，设计并筛选合适的候选抗体结构，并考虑是否需要进行CＲA。由于CＲS 有可能给人体带来严重的危害甚至导致死亡，因此即使作用机制不涉及细胞因子释放，在以下情况下都应进行体外CＲA，以识别临床可能出现的CＲS 风险［19］: 

① 单抗可与免疫细胞或其他能够产生细胞因子/趋化因子的细胞( 如内皮细胞、成纤维细胞等) 表面的靶点或FcγＲs 结合。

② 抗体与FcγＲs 有很强的交联能力，即使靶细胞不表达细胞因子。

③ 对于靶向可溶性靶点的单抗，通常不要进行CＲA。但也有例外的情况，例如: 有比较强的证据提示有免疫复合物的形成( 如靶点为多聚体蛋白) ，或靶抗原在免疫细胞表面存在膜蛋白形式的剪接体( 如IL-6) ，这时就需要进行CＲA。

④ 2 个临床经验有限的单抗联合使用，即使单个抗体已阐明无诱导细胞因子释放的潜力。值得注意的是，体外CＲA 并不能预测大量细胞凋亡/坏死导致的细胞因子释放( 如肿瘤裂解综合征) 。

目前业界已开发了多种CＲA 检测平台，不同的研究者采用的方法也多种多样，所选择的受试抗体呈现形式、细胞类型、阳性对照抗体、细胞因子检测方法和检测时间点等均各有不同。受试抗体的呈现形式主要包括可溶性形式( 液相) 、湿法或干法直接包被( 固相) 、抗Fc 抗体捕获固定或与免疫细胞和靶细胞共培养，其中可溶性形式和干法直接包被占大多数。受试细胞包括全血细胞、外周血单个核细胞( peripheral blood mononuclear cell，PBMC) 、PBMC与内皮细胞共培养等［25 － 26］。目前，国内外尚无专门针对CＲA 的技术指导原则，也无标准的试验方法，应基于受试抗体的靶点、涉及的细胞群和可能的作用机制选择并优化CＲA 方法。在选定CＲA 方法后，需了解这种方法出现假阳性和假阴性概率，而这很大程度上取决于所选择的阳性对照和阴性对照。为降低因细胞因子分析检测时间点错误所导致的假阴性风险，应首先采用不同的供者细胞评估细胞因子释放的动力学特征，研究中应伴随阳性对照，阳性对照最好能够反映可能的/所期望的细胞因子释放机制。如果作用机制涉及FcγＲs 参与，应采用包含所有表达FcγＲs 的细胞( 包括中性粒细胞和血小板) 和补体的全血细胞，并以阿伦单抗( Campath)作为阳性对照［27］。而对于直接靶向T 细胞和作用机制可能涉及靶点聚集的抗体，基于PBMC 的CＲA可能更加敏感，muromonab ( 靶向CD3 的单抗) /TGN1412 更适合作为阳性对照［28］。如果靶点仅在组织中或疾病状态下表达( 如肿瘤细胞、激活的效应细胞或自身致病性细胞) ，或者所涉及的细胞在全血/PBMC 中并不存在，在CＲA 试验中可能采用细胞系或原代细胞( 如肿瘤细胞、成纤维细胞、内皮细胞或过表达激活所需靶点的细胞) 以模拟体内的疾病状态。如果同时存在细胞因子释放和血小板激活/聚集的风险( 如单抗可与血细胞板细胞表面受体结合，或ADA 形成的免疫复合物可与血小板表面的FcγＲ IIA 结合) ，这时就需要考虑FcγＲ IIA 基因多态性( 包括FcγＲ IIA 131 H/H，FcγＲ IIA 131 H/Ｒ和FcγＲ IIA 131 Ｒ /Ｒ 这3 种剪接变体) 对反应的影响，因此应采用包含不同FcγＲ IIA 变体的供者细胞进行试验［19］。所选择检测细胞因子应与特定的作用机制和所担忧的安全性高度相关，由于IL-6， IL-8， IFN-γ 和TNF-α 常与临床细胞因子释放有关，因此建议常规检测。其他可检测的细胞因子还包括IL-1β， IL-2， IL-5， IL-10， IL-12 和IL-17［29］。目前，有多种方法可用于细胞因子定量检测，其中最常用的是多重细胞因子检测，这种方法可以从少量的血清或血浆样品中检测评估大量的细胞因子。若有可能，药物浓度应在预测的人体有效药物浓度范围内，但由于体外静态系统难以反映药物在体内的动态特征，如组织分布、代谢和长期暴露等。为研究给药后所导致的急性反应，可基于人体拟用剂量下的Cmax选择体外CＲA 中的受试物浓度［19］。

对体外CＲA 的结果解释需要考虑多方面的内容包括: 拟用的患者人群、靶点的生物学特性、作用机制及新颖程度( 对于没有临床经验的first in class产品需特别谨慎) ，细胞因子释放属于预期药理学作用还是非期望的不良反应，细胞因子的来源，例如: 来自T 细胞的IL-2 可导致效应记忆T 细胞快速扩增，需要引起高度注意。这与从NK 细胞、巨噬细胞和中性粒细胞中来源的细胞因子是不同的; 不同供体间的反应频率与基因多态性的关系。结合体外CＲA 的结果以及已有的药理毒理学数据，基于证据权重分析方法，项目团队可能做出的决策包括:

① 在确定给药途径、给药剂量、给药速率、给药频率给予相应的考虑。

② 对药物进行改造，改变药物的结构。例如: 采用单价抗体结构以避免靶点的交联和聚集，采用工程方法使Fc 功能沉默等。

③ 排除风险增加的人群。

④ 制定风险控制计划，加强给药后监测，制定明确的紧急干预措施，如给予类固醇皮质激素、细胞因子/受体阻断剂等。

⑤ 结合拟用患者疾病的严重程度，预期的风险获益比，风险的可监测、可控制和可接受程度，已有的替代治疗方法及可及性等，综合考虑是否继续开发。

四小结

与小分子药物不同，单抗的毒性反应主要是放大的药理学作用，其有效性、安全性和药代特征与其类别、结构、靶点特性、作用机制密切相关。在早期筛选设计候选抗体时，应综合考虑当前对疾病病理学机制、靶点表达分布和功能特性的认识以及预期的作用机制，选择合适的IgG 亚型或Fc 结构，甚至可能需要进行工程改造以去除对有效性无任何贡献的功能或者增强拟用的功能活性。在制定非临床计划时，应基于对风险因素的理解及临床拟用情况合理设计非临床试验。在对非临床研究结果进行评价时需关注人体转化的相关性和局限性，尤其要关注因体外/体内、动物/人体、健康人/患者之间靶点表达及功能活性差异所导致的非临床研究结果外推至人体的不确定性。在推算首次人体临床试验起始剂量时，应综合考虑所有的体外体内的药理学、药动学及毒理学试验数据，尽可能建立完整的剂量/暴露量/靶点占有率-反应曲线关系，以确保所选择的起始剂量能够出现预期的药理学作用，且在安全剂量范围内，随后剂量递增时应基于新获得的人体数据对建立的药动学/药效学模型不断修正［30］。