3D打印TiNi合金的生物相容性

 

摘要：随着“精确诊疗”概念的普及，临床对植入材料个性化的需求越发迫切，3D打印技术能够根据患者需求个性化地定制植入物形状，并且可精确控制植入物的复杂微观结构。3D打印在硬组织植入领域研究主要集中于钛及钛合金，NiTi形状记忆合金作为重要的生物医用材料已经获得了广泛的应用，但Ni离子在人体环境中的释放引起了人们的忧虑。本文介绍了TiNi合金的生物相容性以及TiNi合金的表面改性技术，并提出可通过3D打印制备多孔TiNi合金并对其进行表面复合处理，以满足临床需要。

 

关键词：3D打印、TiNi合金、生物相容性、表面改性

 

01前言

 

1.1 TiNi合金

 

TiNi合金是一种典型的功能材料，1962年Buehler等人发现等原子比TiNi合金的热弹性形状记忆效应，该合金通过不同的成分及合成工艺呈现不同的形状记忆效应（SME）和超弹性(SE)[1]。TiNi合金还具有优异的力学性能、耐腐蚀性、耐磨性以及生物相容性，因此在生物医学等领域常作为植入物材料被广泛应用[2]。TiNi SMAs与人骨摩擦时摩擦系数小、磨损量低，其强度及疲劳性能均高于不锈钢。TiNi SMAs弹性模量低于不锈钢，与人骨接近，更适合骨质生长[3]。TiNi合金的高弹性，使之被广泛用于支架材料[4]。

 

医用支架最初由不锈钢制成，但目前广泛使用的是TiNi合金，因为TiNi合金不仅具有超弹性和智能材料效应（SME），而且具有良好的生物相容性，表现优于其他材料。根据TiNi的合成机理，成分的变化会影响过渡温度，高温处理过程中会产生杂质元素，导致氧化和组织缺陷，而且由于TiNi合金形状记忆特性使其难以精密加工，并造成大量的刀具磨损，以及最重要的是形状定型和退火等热处理可以影响钛镍合金的相变行为[5]。另外研究表明若利用传统的加工工艺，在TiNi合金表面会产生大量的微毛刺，而这种微小的毛刺和粗糙表面会对血管造成损伤。TiNi合金进行传统加工时，不能释放加工热和内应力，因此这种合金并不适合传统的加工工艺[6]。

 

1.2 3D打印TiNi合金

 

随着医学技术的不断发展以及临床对生物材料需求的不断提高，所需植入物的复杂程度以及相关性能均有很大提高，利用传统加工工艺很难完成，而3D打印技术则可满足这些需求，3D打印可用于其他手段无法实现的复杂几何图形。3D打印又称为增材制造（AM），在生物材料领域受到广泛关注，这个家族的技术也被称为快速原型（RP），已经成为目前用于组织工程的新型植入物和3D支架开发技术的一部分[7]，目前的3D打印技术有能力改变现代医学。

 

增材制造技术，原理是将计算机设计出的三维模型分解成若干层平面切片，然后把“打印”材料按切片图形逐层叠加，最终“堆积”成完整的物体[8]。3D打印能够根据患者不同组织器官的具体解剖数据，利用计算机设计构建个性化三维支架材料，快速精确的重建缺损组织/器官，如骨、软骨、肌肉、血管等[9]。结合国内外对增材制造工艺的分类，其中涉及金属材料3D打印的技术主要可分为材料喷射（Material Jetting）、粘合剂喷射（Binder Jetting）粉末床熔融（Powder Bed Fusion）、定向能量沉积（Directed Energy Deposition）、薄材叠层（Sheet Lamination）5类，其中又以粉末床熔融和定向能量沉积为主流[10]。

 

目前，3D打印骨科植入物金属原材料的研究主要集中于钛及钛合金，该材料具备3D打印技术独特的优势以及钛金属本身良好的生物相容性和力学性能，如目前已使用 3D 打印技术制造钛合金胸肋骨，并应用于大范围胸壁缺损的重建修复，以期满足个性化、解剖学的胸壁重建需求并观察其临床疗效[11]，是3D打印技术在医疗行业发展最快速、临床转化最多的领域之一[12]。TiNi合金形状记忆材料，在一定的刺激下能够恢复原来形状的金属合金（SMAs），形状记忆材料（具有形状记忆效应的材料）可以被3D打印，具有可重复性和可打印性，其利用增材制造的工艺可见图1.1[13]。目前，3D打印钛合金植入物的成型工艺主要以选择性激光熔融（Selective Laser Melting，SLM）和电子束熔化成型（Electron BeamMelting，EBM）两种技术为主[12]。

 

 

图1.1 TiNi合金增材制造方法

（SLS——选择性激光烧结；SLM——选择性激光熔炼；

LENS——激光工程化近净成形；EBM——电子束熔化成型）

 

02生物相容性

 

生物相容性是生物医用材料的重中之重，生物材料的成功很大程度上取决于它与生物环境的相互作用。所谓生物相容性，即材料在具体应用中表现出的适当的宿主反应的能力 [14]，是现阶段评价生物材料性质的最重要的指标。植入材料生物相容性取决于与活体系统之间的相互作用，这种作用包括两个方面，一是由于材料的组成物质或其降解产物在体内环境下对植入组织周围或邻近组织甚至整个生命体所产生的影响；二是由于宿主组织对材料的作用，主要表现为材料在体内生理环境下的腐蚀、降解和吸收[15]。生物相容性的检测方法包括体外实验和体内实验，体外实验揭示材料与组织之间的反应性质，即在离体实验中，常利用对细胞、血液及蛋白质等生理物质进行观察分析，了解材料与组织的反应关系；体内实验是为了进一步对材料处于动态时的生物学行为进行生物相容性检测[16]。其中包括细胞毒性、遗传毒性和致癌实验、血液相容性、过敏试验、组织学观察等[16][17]。

 

由于新兴的3D打印技术的操作流程与传统加工过程存在较大差异，3D打印技术生产的钛及钛合金产品是否具备生物医用材料所需要的安全性是业界普遍关注的问题。吴利苹[18]等人分析了3D打印技术生产的钛及钛合金在耐腐蚀性、生物相容性方面的性能，经过大量学者的生物学实验证实3D打印和铸造法制作的钛及钛合金试件都具有良好的生物安全性，3D打印技术不会改变材料的生物安全性，且在某些条件下，3D打印试件的性能更优于传统加工。

 

2.1 细胞毒性

 

细胞毒性实验是指应用体外细胞培养的方法，通过检测材料或者其浸提液对细胞生长情况的影响进行判断，细胞毒性与被测材料的量尤其是与表面积有关[19]。可通过直接法和间接法两种方式检测：直接法是将样品细胞直接种植在材料上，然后在适宜的条件下进行共培养；间接法是将架材料用含有DMEM（培养基）的离心管对样品进行处理后得到提取物，通过中性红染色、XTT比色法处理等方法检测细胞活性，从而评价该材料的细胞毒性。有关体外细胞毒性实验表明[20]，不同表面状态TiNi合金、浸提液及其加速降解产物的细胞毒性都属于0~1级，具有较轻微的细胞毒性。TiNi合金、浸提液及其加速降解产物中Ni含量与细胞毒性之间未见剂量效应关系。在遗传毒理学试验中未发现致畸变、致突变作用，但是由于个体组织内部有差异，还需对其毒性进行深度研究，以确保长期使用安全。林学志[21]等人对定制3D打印的钛合金板进行生物相容性研究，其细胞毒性测试中，各组细胞培养均未见明显凋亡，表明3D打印平板的细胞相容性不低于常规平板。

 

2.2 遗传毒性和致癌实验

 

遗传毒性和致癌实验是生物材料中最复杂的问题，Ames实验，是检测基因突变最常用的方法[19]。急性全身毒性实验用于评价材料短期内对机体的毒性作用[22]。为了能更加准确地对遗传毒性与致癌性作出评价，一般还需要进行体外染色体畸变和微核实验作为补充[19]。周星等[23]人针对人工食管用的TiNi形状记忆合金，采用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验研究其生物遗传毒性，结果表明TiNi形状记忆合金的遗传毒性呈阴性，具有良好的生物相容性的TiNi合金可作为人工食管的支撑材料。

 

2.3 血液相容性

 

血液相容性[19][22]是生物材料与血液接触时对血液破坏作用的量度，包括是否能够导致血栓生成、红细胞的破坏、血小板的减少或激活；能否激活凝血因子和人体系统；能否影响血液中各种酶的活性；能否引起有害的免疫反应等，溶血实验能敏感地反应试样对红细胞的影响，若材料有溶血作用，则材料可能有细胞毒性。但由于体内凝血机制及个体复杂性，评价标准并不统一，没有标准化。郭海霞[24]等人对TiNi合金与CoCrNiW和CoCrNiMo进行动态凝血实验，结果表明TiNi的抗凝血特性优于两种钴合金，根据溶血率的比较也得出TiNi对红细胞的破坏程度最轻，可见TiNi合金表现了较优的血液相容性。

 

2.4 组织学观察

 

组织学观察[16]指的是在动植物体内种植生物材料经过一段时间的培养，进行组织学切片观察的方法，植入物周围纤维包膜的形成常被认为是材料与基体组织间的理想反应，是提示材料生物相容性良好的重要指标[25]。这是一种体内实验的方法，借助各种显微镜的使用，能真实地反映材料与生物体的反映情况，对于材料的临床应用是必要的。上述林学志[21]等人定制3D打印的钛合金板经过肌肉植入实验，通过观察和组织学测量显示各组家兔创而愈合均显著，3D打印组平板被肌肉组织包裹，未见囊腔等炎症反应，该组肌纤维部分断裂，但是仍保持基本的纤维束形态，肌细胞排列正常，胞浆均匀，细胞核清晰，与普通组无显著区别，没有组织损伤或炎症。

 

2.5 形态学观察

 

形态学观察[16]是基于生物材料一起培养的细胞形成的形态学和生物化学特征的一种方法，此法可用于体内体外的研究，应用各种染色法可观察到细胞与组织的各种形态学特征。这是一种所有方法中最基本最传统的方法，使用也最广泛。Oleg V.Kokorev[26]等人观察由SHS法制成的多孔TiNi合金的细胞的演变形态学特征，细胞积极生长并繁殖，第7-14天松散的纤维结缔组织的主要成分形成，第21-28天形成致密的结缔组织。

 

2.6 多孔结构对生物相容性的影响

 

TiNi是目前唯一投入实际应用的形状记忆合金，已成功应用于支架、导管、正畸线等领域，但是这种合金制作的植入物与骨头的弹性模量差别较大，这种不匹配会对生物组织产生力学屏蔽，从而会促进生物组织的反应[16]。为了进一步降低弹性模量，使用钛及钛合金的多孔材料是一个非常有效的方法，弹性模量可以很容易地通过孔隙率的变化来调节。而且多孔结构可降低其密度并提高渗透性，从而使新的骨骼组织更易于在内生长、体液更易输送[27]。而且发现多孔合金能够在没有表现出明显炎症和排斥反应的基础上，很好地实现骨组织的内生，长入的速率随时间而增加，甚至在几周后可以达到大范围地长入[14]。多孔具有很好的骨重构性和高的渗透性和组织粘附性[28]。但是，多孔结构有较大比表面积，因此对于医用多孔合金来说，良好的表面耐蚀性能和生物相容性就显得非常重要了。目前已经有大量的体外体内试验和临床使用表明，多孔形状记忆合金具有人体可接受的生物相容性[14]。

 

2.7 Ni离子的腐蚀

 

人体体液中包含大量水、氧、蛋白质和各种离子，他们可使TiNi合金成分中含量约50%~55%的Ni可能释放，形成局部高浓度的Ni离子溶液，Ni虽然是人体所必需的微量元素，然而镍过量也会对人体造成伤害，长期接触镍可引起接触性皮炎、贫血、慢性鼻炎等疾病[29]，其含量在体内的升高、降低都会对机体免疫系统、造血系统等功能造成影响，甚至具有致敏、致癌、致突变等严重影响[30]。因此，国内外众多学者对于镍离子的腐蚀溶出问题做了大量的研究工作。

 

TiNi合金具有优异的生物相容性，这是不争事实。在空气中，钛被一层致密惰性的氧化膜覆盖而免于被腐蚀，主要就是这层氧化膜使钛具备了良好的生物相容性[16]，对于TiNi合金，由于钛原子氧亲和力比镍原子高， Ni-Ti SMA表面会形成这层TiO2膜，该膜能有效阻止镍离子的释放，但是一旦破坏难以自行恢复。在体内腐蚀条件下，循环负载可能导致TiO2膜破坏，保护性氧化物层失效[29]。对NiTi合金的离子释放测量表明，镍离子的初始释放速率很高，但下降很快。研究金属植入体材料特定使用环境中的腐蚀过程和行为的研究具有现实意义，梁成浩[31]等人采用电化学测试技术，在生理盐水中对生物医用TiNi基SMA的腐蚀行为进行研究，验证了析出物成为孔蚀诱发的敏感位置，认为尽管TiNi SMA 有着良好的耐全面腐蚀能力，但具有孔蚀敏感性使得潜在的生理危害性增加，因此TiNi合金作为长期植入人体的植入器械可能并不十分合适，验证了王小祥、郭海霞[24][32]等人提出的结论。在模拟唾液的中低电位下，镍钛记忆合金中镍离子的腐蚀溶出量较大，比在其他生理环境中严重， 几乎相差10倍[30]。

 

解决这一问题的较好办法就是建立一个屏蔽层来抑制Ni进入体液，郑斌[33]等人采用等离子体源增强磁控溅射和沉积技术，在TiNi合金表面成功镀制了梯度DLC（类金刚石）膜，结果表明该膜显著地增强了TiNi合金基体的抗腐蚀能力，以及表面改性没有明显影响TiNi合金基体的使用性能。闻雅[34]等人在TiNi合金表面进行W离子注入，研究表明离子注入显著抑制了TiNi合金在Hank’s溶液中Ni离子的析出，提高了TiNi合金的耐腐蚀能力。D.Ionita[35]在人造唾液环境中分析经过老化处理TiNi合金的耐蚀性，得出具有耐蚀性可以用两种机制解释：亚稳态沉淀物与NiTi基质具有相干或半相干边界，它们的应力场导致腐蚀过程，以及用较大量的钛富集表面钝化膜，可形成更具保护性的二氧化钛外层来提高耐腐蚀性。已有研究确定，钝化氧化物层的均匀性和稳定性而不是厚度对于防止TiNi腐蚀更重要[36]。D.N. Awang Shri[37]等人检测钛镍合金在HPT（高压扭转）变形前后的腐蚀行为，结果表明HPT变形后TiNi合金上形成了更稳定和保护性的钝化膜，这是因为HPT变形后在TiNi合金中引起的结构变化会形成更均匀的钝化膜，提出该研究中TiNi耐蚀性的提高可能归因于HPT形变引起的纳米化和非晶化。纳米结构合金的耐蚀性可归功于提供快速扩散路径和高密度晶界，微结构的变化可能影响钛镍的腐蚀行为[38]。

 

03TiNi合金的表面改性

 

TiNi合金已被用于支架技术、整形外科、正牙学和心血管、神经外科等领域，对比不锈钢等其他合金材料，TiNi合金是生物医学植入物的更好选择。但是在机械和热负荷条件下，TiNi合金与人体生物系统的腐蚀倾向更大，因此在循环载荷、拉伸等条件下长期使用可能会释放出不需要的Ni离子，使得这种材料的生物相容性成为一个重要问题[39]。对NiTi合金的离子释放测量表明，镍离子的初始释放速率很高，但下降很快，NiTi生物相容性的降低似乎是由于合金的腐蚀和离子释放[40]。吕晓迎[41]等人采用MTT法评价Ni2+在处理L929细胞后的细胞毒性并与采用BiostarM-140s芯片检验做出比较，结果表明MTT法处理细胞24h后虽然细胞毒性为0级，但是已经引起了636个基因发生差异表达，详细分析后发现此时已经对细胞功能产生了较为广泛的负面影响。

 

因此需要对TiNi合金进行表面改性，表面改性一方面可降低镍离子释放，另一方面可提高其生物相容性。为此，国内外大量学者做了大量的研究工作，从多种角度对合金表面进行改性，以提高其生物相容性，供人体长期使用，如表3.1。

 

表3.1 医用TiNi合金表面改性方法

 

序号	方法	结果	参考文献
1	离子注入技术（W、Cr、O等）	耐蚀性提高，减少镍释放量，未产生有害的机械、生物效应。	[34][42][43]
2	严重塑性变形的HPT技术	SPD引起的纳米化和非晶化提高了TiNi合金的腐蚀行为，抗蚀。	[37]
3	等离子体沉积	耐蚀性提高，制成梯度DLC膜	[33]
4	等离子体表面合金化	钼改性层，耐磨性提高，抑制镍的释放	[44]
5	超细晶TiNi合金电化学抛光	纳米级蚀坑，耐蚀性、耐磨性、生物活性均提高	[45]
6	等离子喷涂Ti和TiNb涂层	涂层后的NiTi合金可有效防止金属表面Ni2+释放，提高NiTi合金的生物相容性和安全性。	[46]
7	低温去合金化（脱镍）	完全无镍的具有纳米网架结构的水合氧化钛膜，诱导Ca、P沉积生物活性提高。	[47]
8	微弧氧化	含Ca、P的均匀微孔涂层无裂纹，血液相容性好	[48]
9	热氧化处理	生物学评价项目均符合GB系列标准的要求，表面可检测到的镍离子大大减少，NiTi上人内皮单层的完整性取决于合金的表面化学性质，可以使用简单的氧化热处理对其进行控制。	[49][50]
10	机械抛光后热处理	表面上仍残留大量的金属镍或氧化镍	[50]
11	磁性抛光	支架表面粗糙度降低了2.3至17.9 pct，并且支架从导管中展开的推出力更低。	[51]
12	电解抛光	对抗折性能及抗腐蚀性能研究结论不同，有争议	[52]
13	溶胶凝胶法	表面致密稳定的SiO2涂层有优异的耐蚀性，能有效阻止镍离子从合金基质中溶出。	[53]
14	电化学沉积--碱处理	羟基磷灰石涂层，改善组织相容性及生物活性	[54]
14	仿生溶液生长法	在多孔TiNi合金表面形成致密且均匀的羟基磷灰石涂层，展现出良好的生物相容性，在一定范围内，孔隙率的增加有利于羟基磷灰石的形核与生长。	[55]
15	逐层（LBL）自组装方法	聚乙烯亚胺/肝素薄涂层具有较好的耐腐蚀性和血液相容性。	[56]

 

机械抛光、电化学抛光和热处理TiNi的结果显示，在成纤维细胞毒性和细胞相容性、内皮细胞相容性和溶血方面，表面修饰之间没有差异。然而，与机械抛光和电化学抛光的NiTi相比，热处理的NiTi表面的血栓形成性显著降低。血小板铺展的差异归因于表面镍的表面浓度和氧化状态[40]。热氧化、自组装和表面去合金化技术以其简便易行、膜与基体结合力强、可处理复杂几何表面器械等优势显示出良好的应用潜力[30]。

 

 04 结语

 

利用3D打印技术可制备多孔TiNi合金材料，多孔植入体的设计可以改善骨向表面的嵌入，减少骨与金属表面弹性模量的差异，防止植入物的无菌性松动，提高其长期的稳定性。传统的制造方法不允许制造具有高分辨率的复杂多孔结构，而采用3D打印技术，可使得我们能够制造用于硬组织工程的复杂多孔植入体[57]。3D印刷的多孔钛镍合金具有良好的机械性能和内部多孔结构，这也为填充药物提供了理想的空腔[57]。孔径的形状大小均可影响细胞的行为，在孔隙尺寸相同的前提下，细胞受到的机械刺激越强烈，细胞更易于分化[59]。而且也有研究证明[55]可在多孔TiNi合金表面制备涂层，展现出良好的生物相容性，在一定范围内，孔隙率的增加有利于生物相容性。

 

大量研究[60]表明植入体表面合适的微米结构或纳米结构对细胞的行为表现出积极作用，能够增加植入体的生物活性和生物相容性，而兼具微米与纳米多级结构表面的种植体表现出微米和纳米结构的协同效应。经过多年纳米技术的不断发展可知，将材料颗粒缩小至纳米限度时，它的多方面性能都能得到明显改善[61]。因此可以考虑，根据不同需要在TiNi合金表面形成微米级、纳米级或微纳米级的蚀坑和涂层。热氧化处理后检测到的镍离子含量大大减少[50]，热氧化是一种工艺简单，性价比高的原位生长的镀膜工艺，因此也有报道指出，喷涂纳米颗粒钛、碳化钛或氮化钛末再进行热氧化，制备功能薄膜[62]。

 

表面阻挡层如氧化钛、氮化钛或碳化钛已被证明能提高致密NiTi表面活性剂的耐磨性、耐腐蚀性和生物相容性。与传统的致密NiTi相比，多孔NiTi复杂的表面形貌和大的表面积给镍的释放带来了更严重的问题。因此对表面改性技术的要求更加严格[43]。

 

由于考察角度、实验方法、测试设备的差异，镍钛记忆合金生物相容性的评价结果目前仍存在许多争议[29]。生物学评价从整体、细胞、分子生物学以确保生物材料安全地应用于人体组织，根据GB/T 16886.1中的要求，未涉及在生物化学和分子生物学层面，这应该是未来需要探究和发展的方向[49]。当前对于含镍钛医用合金植入人体内镍离子的代谢过程方面的研究尚不够系统和全面[30]。组织内镍的扩散动力学也与培养基不同，因此镍在人体内的扩散动力学有待进一步研究[28]。对于多孔材料，关于孔径形状的影响缺乏体内实验，有待于进一步完善。

 

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