角膜是眼前部具有多层结构的透明组织，本文通过数字光固化3D打印技术（DLP）制备了聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）/甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶，其具有足够力学性能、高透光率、高形状保真度、适宜的溶胀度和降解速率以及优异的细胞相容性，兔前板层角膜移植手术表明所构建的负载细胞的仿生双层水凝胶支架能够促进上皮愈合和基质再生。

01 研究内容简介

角膜主要由五层结构组成，从上到下分别为上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层，其对于折射、穿透光线具有重要作用，但由于烧伤、灼伤、外力损伤等原因，角膜疾病如今已经是致盲的主要原因之一。虽然现有的人工角膜（如 AlphaCor和Boston）具有高度的透明性，可以在短期内作为角膜替代物，但是由于其通常为不可降解以及生物惰性的材料，无法与自身组织相融合，因此舒适度差，美观性低，长期穿戴可能会对周围组织造成损伤。近些年来，组织工程以及3D打印技术迅猛发展，为人工角膜的个性化制备提供了一种强有力的方法，同时3D打印可以制备具有不同结构、不同尺寸参数、负载不同细胞的人工角膜，具有很大的发展前景。受此启发，本文以PEGDA/GelMA为墨水，使用数字光固化打印技术制备水凝胶，并对其理化性质、细胞相容性以及在体内对角膜愈合的影响进行表征（图1）。

图1.（A）PEGDA-GelMA水凝胶中墨水的成分和网络形成的示意图。（B）使用由含有rCECs的上皮层和含有rASCs的正交排列的纤维基质层组成的双层圆顶形角膜支架，描述了3D生物打印过程及其在兔角膜切除术模型中的应用。

本文通过改变PEGDA的固含量制备了三种比例的水凝胶。在拉伸和压缩测试中（图2），PEGDA-GelMA-20-5水凝胶具有82.2 kPa的拉伸强度，77.2 kPa的拉伸模量和100.7 kPa的压缩模量，能在保证手术操作的同时保留负载细胞的能力，压缩模量接近于天然角膜的压缩模量，有利于术后抵抗眼压。此外，PEGDA的加入还提高了GelMA水凝胶的韧性和打印性能。

图2.GelMA和PEGDA-GelMA水凝胶的机械性能。（答1）代表性拉伸应力-应变曲线及其相应的（A2）拉伸应力，（A3）断裂伸长率和（A4）拉伸模量。（地下一）50%应变、（B3）压应力和（B4）压缩模量之前的代表性压应力-应变曲线及其对应的（B2）应力-应变曲线。（C）使用机械试验机对GelMA-5和PEGDA-GelMA-20-5水凝胶进行压缩处理。（D） 印刷的GelMA-5和PEGDA-GelMA-20-5水凝胶盘。

  如图3所示，其他理化性质测试表明此打印水凝胶能够在1天内达到溶胀平衡，一个月的时间内在胶原酶溶液中缓慢降解，并具有适宜的溶胀度和降解速率。透光率测试表明在600 nm处，水凝胶均能保持80 %以上的透光率，并大于天然兔角膜的透光率。流变测试结果显示PEGDA-GelMA-20-5水凝胶具有3.1 kPa的储能模量，与天然角膜相近。

图3.PEGDA-GelMA水凝胶的表征。（A）水凝胶在37°C的PBS中孵育14天后的膨胀程度。 （B）在37°C的PBS中存在胶原酶（50U / mL）时水凝胶的降解曲线。 （C）水凝胶和天然角膜的光学透射率在400-800nm之间。（D） 显示天然角膜、印刷角膜和印刷圆盘透明度的照片。 （E） 频率范围为 0.1 至 10 Hz 的水凝胶频率扫描曲线。 （F） 根据 （E） 计算的平均储能模量 （G'） 和损耗模量 （G''）。

使用兔角膜上皮细胞测试水凝胶的细胞相容性（图4），结果显示水凝胶能够支持细胞的迁移、黏附和增殖。将凝胶前驱液与细胞进行混合并作为墨水进行打印，7天后测试细胞存活率，仍能达到90%，并且凝胶的透光率也能达到88.9%。

图4.PEGDA-GelMA-20-5水凝胶的体外细胞相容性。（A）2D划痕测定中rCEC的代表性活/死图像。（B）定量水凝胶和对照样品中划痕区域的相对细胞密度。（C）接种在PEGDA-GelMA-20-5水凝胶表面上的rCEC的代表性活/死图像。（D）CCK-8细胞在水凝胶上的增殖结果。（E）生物打印后7天封装在水凝胶中的rCEC的代表性活/死图像。（F）在生物打印后1，3，5，7天，rCECs负载水凝胶在400-800nm之间的透明度变化。活/死图像中的比例尺：300 μm。

为了考察墨水的可打印性，使用DLP打印机，对PEGDA-GelMA-20-5进行不同模型的打印。如图5所示，经过逐层光固化，此墨水可以成功打印出兔子、皇冠、带孔圆片，并具有足够的强度和透明性。为了模拟角膜基质层中正交的胶原纤维结构，对水凝胶进行正交结构的打印，结果显示水凝胶的打印精度较高，显微镜下的正交部分清晰可见，细胞分布均匀且具有较高活性。通过改变光吸收剂的浓度和曝光时间，本文还打印出了负载兔角膜上皮细胞的角膜结构，其具有良好的光滑度和适宜的厚度、曲率，与天然角膜相似。

图5.PEGDA-GelMA-20-5水凝胶的印刷性评估。（A1）打印兔子的3D模型和（A2）数码照片。（地下一）印刷穿孔盘的数码照片和（B2） 显微照片。 （C1）3D模型和（C2）印刷冠的数码照片。（C3）浸入PBS后的冠顶视图和（C4）侧视图。（D1）3D模型，（D2）数码照片和（D3）打印的正交排列纤维结构的显微照片。（D4）培养2天后评估正交排列的纤维物体中的live/死rCECs活力。（E）在细胞培养基中浸泡2天后印刷的水凝胶。印刷水凝胶 disc （F1） 带和 （F2） 不带光吸收剂。白色圆圈表示预定的打印区域。（G） 印刷角膜支架。比例尺：300 μm。

为了考察PEGDA-GelMA水凝胶在体内对角膜愈合的影响，本文打印出负载兔角膜上皮细胞的上皮层以及负载兔脂肪间充质干细胞的正交纤维基质层，并进行兔前板层角膜移植术将水凝胶移植入角膜损伤处。1个月的裂隙灯检测（图6）以及组织学染色（图7）表明，水凝胶能够加速上皮愈合和基质再生，正交纤维结构的存在和干细胞的双重作用为角膜基质细胞提供了最有效的再生环境。

图6.ALK 兔模型中 3D 打印双层角膜支架的体内评估。 （A） 角膜移植术的外科手术，包括通过环钻和刮刀去除角膜上皮基质的某一部分、植入水凝胶和覆盖缝合。（B）具有代表性的裂隙灯和钴蓝色照片，在不同时间点将水凝胶应用于兔角膜后的体内应用。角膜上皮缺损（中央角膜绿色区域）大小的逐渐减小与上皮在水凝胶和缺损上的迁移有关。

图7.在ALK的兔模型中应用3D打印双层角膜支架后进行组织学和基因表达分析。 （A1）手术后1天用（A2）Col I和（A3）CK3抗体（绿色）对角膜进行H&E染色和免疫染色。（地下一）手术后28天用（B2）Col I，（B3）CK3，（B4）LUM和（B5）SMA抗体（绿色）进行H&E染色和免疫染色。红色箭头和矩形分别表示未完成的上皮和基质区域。在所有图像中，细胞核与DAPI（蓝色）共染色。比例尺为200μm。从H&E图像获得的手术后28天角膜的（C1）总厚度，（C2）上皮和（C3）基质层的厚度。（D1）KERA，（D2）ALDH，（D3）AQP1在角膜中的相对基因表达，在手术后28天通过PCR定量。该值反映了正常角膜上mRNA表达的倍数变化。

综上所述，此3D打印仿生上皮/基质双层水凝胶具有与角膜相近的理化性质，优异的细胞相容性和体内生物相容性，能够加速角膜愈合，减少瘢痕的产生，具备应用于角膜再生与修复中的潜力。