近 40 年来，亲和层析 (AC) 已被广泛用于大规模生物工艺，被认为是各种类型生物药下游工艺中初步捕获的首选方法。本文的目的是介绍a：生物工艺亲和层析的历史，b：基于亲和捕获步骤的平台工艺的现状，c：定制开发生物工艺亲和填料的成熟领域，d：与其它形式的层析方法相比，基于亲和捕获的下游工艺的优势，以及e：生物工艺亲和层析的未来方向。通过使工艺开发和生产工艺标准化以及在灵活的多产品生产设施中使用连续操作，亲和层析的使用可以带来多方面的经济优势。这些概念将基于日益增长的定制亲和生物工艺填料领域进行讨论。定制亲和填料不仅满足了非平台化工艺对捕获填料的需求，而且还可用于精纯应用，通过将特定产品异构体与所需产品形式分离来定义和控制药物底物组成。

在过去的几十年中，生物技术行业取得了前所未有的成功。生物技术领域专注于开发和商业化一些针对严重疾病的药物，例如肿瘤和免疫系统疾病，以及用于预防大流行的疫苗，其自1979 年第一种生物药获批以来取得了巨大的发展。2018年，商业化生物药的收入达到 2100 亿美元。预计未来 10 年市场将以8.6% 的复合年增长率增长。因此，对生物制药行业商业模式的业务可持续性进行了广泛的讨论，尽管由于开发成本高且新获批的生物药数量相对较少，投资者仍愿意投资和支持新的生物药疗法的开发。考虑到截至2017 年获批的 221 种生物产品中，仅去年一年，十大畅销分子的净值就超过 650 亿美元，这种投资趋势并不令人意外。

同时，该行业现在进入了一个以价格压力增加为特征的新阶段，原因在于i)报销政策；ii) 竞争更加激烈的市场，多个公司基于相似的作用机制、针对相同的适应症开发产品；iii) 由于生物仿制药的获批导致价格下降；iv) 引入新的、昂贵的个性化疗法。因此，该行业需要寻找能够确保更好的投资回报的方法。更好的投资回报可以来自临床成功率的提高、进入临床的更短时间以及生产成本的降低。前两项工作将显著降低每个项目的研发成本，目前估计平均为14 亿美元。关于生产成本，可以说，在获批药物的整个生命周期内，生产的累积成本可能证明与将分子推向市场的成本一样高。因此，降低生产成本可以为母公司带来显著的财务收益，有报告表明，高达25% 的药品价格与其商品成本相关，如采用基于一流技术的优化平台工艺，商品成本可低至售价的1-5%。这清楚地表明，采用正确的生产技术可以在产品生命周期内为母公司及其投资者带来显著的财务收益，并改善患者获得可负担的治疗的机会。

从鉴别工艺经济性潜在改进的角度来看，众所周知，下游操作成本占总生产成本的主要部分。这种较高的贡献是因为必须遵循严格的工艺质量要求、以非常高的纯度生产生物药。一个典型的下游工艺由多个单元操作组成，每个单元的引入都有一个非常具体的目的，即提高产品质量和安全性。然而，这些单元操作中的每一个都会导致整体工艺收率的下降。由于对于给定的设施利用率水平，产量损失是生产成本增加的主要经济驱动因素，因此，任何减少工艺步骤数量、同时维持或增加药物底物纯度的技术，都将是有意义的。一种这样的技术是亲和层析（AC）。亲和层析已在大规模生物工艺中使用近 40 年，被认为是各种类型生物药下游工艺中初步捕获的首选方法。

通过查看用于纯化单克隆抗体 (MAb) 的下游工艺模板，可以发现亲和层析在生物工艺中的重要性。该工艺的核心和灵魂是一个高选择性、高收率的捕获步骤，依赖于基于Protein A 填料的亲和层析。该捕获步骤减少了生产高度纯化的药物底物所需的工艺步骤的总数，从而提高了整体工艺收率并缩短了工艺时间。总体而言，在工艺早期使用Protein A 层析法可提高下游工艺的生产率，从而降低生产成本。实际上，可以说，MAb的商业成功不仅与它们的作用机制有关，而且还因为Protein A 能够实现非常强大的纯化工艺，从而能够大规模生产这些分子。事实上，前文介绍的COG 在生物治疗药物平均售价的 1-5% 范围内的案例就是一种高度优化的 MAb 生产工艺，其特点是高产量和高设施利用率。

在本文中，我们将简要讨论生物工艺规模亲和层析的过去、现在和未来状态，特别强调合适的配基和填料。我们将从生物工艺的角度讨论与亲和层析相关的一般优势，并讨论定制生物工艺亲和填料领域的最新发展。本文不讨论亲和填料优化的原则（例如，颗粒和孔径、配基大小和密度），也不讨论更优化使用这些填料的工艺方法（例如，循环、优化保留时间或连续操作）。这些主题已在多篇文章中有所涉及，包括最近对多种商业化Protein A 填料的评论，其中强调了为实现最佳性能，固定相和配基设计关系的复杂性。

生物工艺亲和层析

虽然亲和层析这个术语最初仅用于基于功能性生物相互作用的层析技术（例如，抗体-抗原；凝集素-糖蛋白；酶-抑制剂），但至少从生物工艺的角度来看，其当前定义的限制较少，并且包括任何目标产品表面上的特定基团和固定配基之间的相互作用（例如，寡组氨酸基序和螯合金属离子之间的相互作用，即所谓的固定金属离子亲和层析法，IMAC）

1  历史的角度

亲和层析这一术语在 1960 年代后期首次在一篇开创性文章中使用，该文章描述了亲和填料的理想特性，并描述了该技术的原理和应用，包括填料结构和偶联技术的重要性。1950年代中期到 1960 年代，第一个小配基选择性层析步骤被开发出来，使用对偶氮苯酚和黄素配基纯化几种酶。免疫亲和层析先于小特异性亲和配基的开发。1951年，Campbell 及其同事使用牛血清白蛋白来捕获兔抗牛血清白蛋白抗体。1970年代引入了能够与多个靶标相互作用的配基。这些分子包括辅酶、凝集素、核酸、金属螯合物、三嗪染料、Protein A 和肝素。大约在同一时间，生产 MAb 的杂交瘤技术的发展使 MAb 在蛋白质纯化中得到更广泛的应用。亲和（免疫亲和）层析在大规模生物工艺使用中的首次应用是在1980 年代使用 MAb 捕获柱纯化商业蛋白质，例如干扰素 α2A和因子 VIII。Mab层析柱的生产是一个复杂的过程，抗体细胞系在培养基（通常含血清）中生长，使用常规层析法或Protein A 层析法从上清液中纯化 MAb，然后将 MAb 化学偶联到填料上。这些填料非常有效，但生产起来非常昂贵，并且在MAb 生产中经常使用动物源性成分。此外，填料难以清洗，并且担心抗蛋白抗体会渗入产品中。由于这些挑战，使用MAb 亲和柱并不是纯化商业化生物药的首选方法。

生物工艺亲和层析的现代历史与Protein A 填料的开发和商业化有关，随后 MAb 成为迄今为止最丰富的生物药类别。Protein A 填料设计的显著改进源于 MAb 滴度的增加以及生物制药管线中大量基于抗体的治疗方法。这些改进包括在固定化学、配基工程和基质设计方面的进步。例如，改进涉及使用重组而非金黄色葡萄球菌、Protein A 以及通过 C 末端半胱氨酸定向的配基偶联。进一步的改进实现了更低的配基脱落以及优化的配基可及性，这反过来又推动了更高的结合载量。MAb的进一步商品化推动了Protein A 配基化学的进一步发展，从而显著提高了化学稳定性，并随后开发了具有更高结合载量的Protein A 填料。多年来开发的其它一些生物工艺亲和填料包括基于蛋白 G、蛋白 L和单域骆驼抗体配基的填料。

2  生物工艺亲和配基

目前，用于生物工艺应用的配基可以是生物来源的或合成来源的。然而，行业已经提出了将配基分别分为生物特异性和假生物特异性的分类方法。无论其来源如何，与生物工艺亲和层析兼容的配基必须表现出高选择性、相对的高亲和性以及与目标产物的可逆结合，从而在相对温和的条件下实现目标产物的洗脱。它们还需要具有化学稳定性，以在层析操作期间、暴露于各种试剂后保持其结合特性。除了上述之外，配基需要容易地结合到支持基质的表面。适合生物工艺的亲和配基的性质列于表 1。

表 1. 生物工艺相关亲和配基的性质

在生物来源的配基中，抗体和抗体片段被用于免疫亲和层析。但是，抗体在化学上不稳定，尤其是在高pH 条件下（例如碱清洗），并且还显示出相对较低的结合载量。与完整抗体相比，抗体片段具有相同的选择性，但更小，可以以更高的配基密度固定，从而产生更高的结合载量。它们不是糖基化的，并且因为它们可以在微生物表达系统中制备，所以生产更便宜。

其它生物配基包括所谓的支架蛋白，它们相对稳定、小（单链），可以通过重组技术生产。支架蛋白经过工程改造，可优化其化学稳定性以及其它层析相关特性。支架蛋白的例子包括affibody、DARPins、affilins、knottin、monobodies和anticalins。

在合成配基中，具有独特二级结构的合成寡核苷酸（例如适体）已用于生物工艺规模的亲和层析，以纯化多种蛋白质，包括：血管内皮生长因子(VEGF121)、来自血清的因子 VII、因子 H 和因子IX。还可使用 Fc 适体填料纯化来自血清的人 IgG。

其它合成性生物工艺配基包括小肽亲和配基和多糖。前者因其与确定的组成以及3D 结构相关的相对简单性、易于大规模生产和无毒特性而受到更多关注。后者包括用于纯化流感病毒的硫酸葡聚糖和用于纯化一些血浆蛋白（例如抗凝血酶III）的肝素等配基。生物工艺中使用的其它类型的配基包括螯合金属离子、氨基酸、染料（例如，用于纯化干扰素、白蛋白和激素的Cibacron Blue）和较小的有机物分子（例如，苯甲脒；硫丙基；核苷磷酸盐；三嗪）。

已经有文章回顾了一些生物制药相关目标蛋白和建议的相应亲和配基的例子。其它生物制剂，如受体，也被用作蛋白质纯化的配基。例如，重组IL-2 受体专门用于纯化活性 IL-2。

3  生物工艺亲和填料

生物工艺亲和填料可分为两类：i) 通用填料，可用于纯化结构上具有特定相似性的生物制品，例如 MAb、抗体片段 (FAb)、腺相关病毒(AAV) 以及ii) 基于一对配基-蛋白质靶标之间的特定相互作用的填料，该配对是唯一的（单一产品填料）。这两类填料具有相同的生物工艺优势，即纯化步骤数量更少，因此整体工艺收率更高，工艺时间更短。

4  通用填料

如上所述，当今的治疗性 MAb 主要使用Protein A 填料作为捕获步骤进行纯化，然后进行一些正交层析步骤，例如离子交换、疏水相互作用或多模式层析。Protein A 的好处是显而易见的，故而被广泛用于MAb 纯化。实际上，到 2023 年，整个Protein A 市场的价值估计将达到 8亿美元，这相当于年产量至少为 40,000 L。

提高Protein A 填料性能的竞赛产生了一个相当容易理解的、所需技术属性列表，这些属性现在被认为是生物工艺应用中使用的任何类型的现代化亲和层析填料的基本要求。这些属性包括：高结合载量、在含有生物工艺典型NaOH 清洁条件下的稳定性；低配基脱落，以及达到数百个柱循环的寿命。除了技术要求外，亲和填料供应的安全性也被视为考虑将填料用于商业化生产操作时的重要属性。在这种情况下，填料供应商必须证明填料能够以所需的规模和所需的质量持续生产，以确保针对预定的生产活动提供不间断的填料供应。

受益于生物工艺亲和捕获步骤的一类生物治疗药物的另一个例子是抗体片段。抗体片段在全长MAb 由于其大小而无效的情况下是可选的治疗替代方案。这包括一些组织和肿瘤，以及细胞内或隐蔽的靶点。这些片段是没有Fc 部分的抗体样分子，包括 FAb、FAb2、BiTEs、ScFv、di-ScFv 和sdAb。Fc 部分的缺乏阻止了它们与Protein A 的结合。然而，这些片段含有对Protein L 显示出亲和性的 kappa 轻链。几种适用于生物工艺的、基于Protein L 的亲和填料已经可以商购购买，并且预计下一代Protein L 填料将受益于用于改善Protein A 配基特性的类似重组技术。

腺相关病毒 (AAV) 和腺病毒是用于体内和体外基因治疗和肿瘤疫苗的几种病毒载体中的两种。亲和填料不仅可用于AAV 和腺病毒，而且还可用于对于其它几种病毒。在最近关于使用亲和层析纯化病毒疫苗的综述中，有人提出，目前有四种传统的亲和技术可用于病毒的cGMP 纯化。其中包括 1) Capto DeVirS 填料，它使用硫酸葡聚糖配基，对各种病毒（包括不同的流感病毒、黄热病病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒和西尼罗河病毒）表现出类肝素亲和行为；2)使用硫酸纤维素的cellufine填料，它也模仿肝素亲和行为，并已用于纯化人类和禽流感病毒、莫洛尼鼠白血病病毒、登革热病毒和西尼罗河病毒VLP；3) AVB Sepharose 高性能填料，它是由 BAC BV（现为 ThermoFisher Life Sciences）开发的免疫亲和填料，使用 14 kDa 骆驼源性重链单域抗体片段，具有广泛的特异性，用于纯化AAV-1、-2、-3、-5、和 -6；4) CaptureSelect AAV8 和AAV9，使用一个 13 kDa 单域片段，包含三个互补决定区 (CDR)，形成 AAV-8 和AAV-9 血清型的抗原结合域。由于对于非常大的分子（例如病毒）的可及表面积较低，这些填料的载量都相对较低。使用具有较大孔的基质（例如用于制备CaptureSelect 填料的基质）可以在一定程度上减轻低表面积的限制。据报道，使用CaptureSelect AAV9 在10 和 50 L 规模上成功地大规模纯化 AAV9，回收率>80%。最近，专门开发了一种新的生物工艺填料(Poros CaptureSelect AAVX)，用于纯化各种AAV 血清型，包括 AAV1-AAV9 以及重组和嵌合载体。

5  单产品（定制）填料

在过去的 30 年中，作为捕获步骤的亲和层析已被确定为一种能够实现具有成本效益的生物工艺的技术。一个合适的亲和填料工具箱可以帮助实现平台纯化工艺无法应用的目标产品的纯化，是一种理想的情况。事实上，一些用于非平台工艺的生物工艺亲和填料已经成功开发并用于大规模商业化生产。一些重要的例子包括前文已经提到的使用基于肝素的填料纯化抗凝血酶III、使用硫酸葡聚糖纯化流感病毒，以及使用Cibracon Blue 填料纯化干扰素和 TSH。

以抗体片段作为配基的商业亲和填料可用于人类生长激素、因子VIII、α1-抗胰蛋白酶和腺相关病毒，并且已经开发了用于因子VIII 的 affibody 结合体。2004 年，Kelley等人报道了一种定制的亲和填料，用于使用选自噬菌体展示文库的肽配基纯化重组 B域缺失因子 VIII (BDDrFVIII)。该填料可从复杂的进样料液中出色地回收BDDrFVIII，并将宿主细胞蛋白质和 DNA 减少 3-4 log。它最终取代了最初的ReFacto Antihemophilic Factor 工艺中的免疫亲和步骤，从而实现了更高的柱载量、更好的填料可清洗性，并消除了动物源性材料（来自免疫亲和配基的生产）。

尽管有上述非常成功地开发以及随后大规模实施用于非抗体产品的亲和填料，但用于MAb 以外目标产品的亲和层析填料仍然不常见。

在 BPOG 2020 技术路线图中，有人提出，定制亲和填料概念采用缓慢的一个潜在原因是“目前为新靶点提供亲和填料的方法具有较长的开发时间线，难以整合到所需的产品开发时间线，并且成功率不确定……”。这一说法可能会受到质疑，因为多家公司声称他们可以在筛选计划开始后的 6-12 周内发现生物工艺相关配基。用于工艺开发活动的原型亲和填料的后续开发将增加这些时间线，但据报道，也有开发时间只有 6周的项目。因此，定制亲和填料可能会在3-5 个月内开发出来。此外，这些程序可以与细胞系和/或上游开发（可能需要 3-6 个月）等产品开发活动并行进行，从而使实施定制亲和填料、以捕获产品的整个过程与产品开发时间线相当兼容。从成功找到配基的角度来看，虽然不能先验地保证会找到配基，但找到合适的生物工艺配基（表 1）的几率随着各种生物工艺证明的配基支架的可用性而提高。

定制亲和层析填料的概念不需要只考虑新的候选药物。其应用的另一个领域是开发传统产品的第二代工艺，或开发用于生产生物仿制药的纯化步骤。在传统工艺的情况下，通过引入亲和捕获步骤，工艺复杂性将降低，产品收率和生产率也将显著提高，新工艺的特点是降低COG，同时保持产品质量。在生物仿制药的情况下，定制亲和层析可以被视为一种赋能技术，在保持上述所有经济利益的同时，提供操作的“智力”自由。在这两种情况下，时间线可能不如为新工艺/产品开发亲和配基发挥的重要作用。

在规模缩小研究（可接受的产品收率和纯度）成功评估新开发的定制亲和填料后，需要与填料制造商签订合同，以确定适当的配基密度范围和偶联技术，进而放大填料生产并为药物的cGMP 生产提供填料。该制造商应具有生产cGMP 填料的历史和声誉，能够控制填料生产过程的各个方面，并能够生成监管支持文件(RSF) 或等效文件。据报道，一个专门的程序可以在4-5 个月内尽快提供 cGMP 填料（Avitide，Repligen子公司）。

最后，填料制造商需应开发一种检测和量化脱落的亲和配基的方法。药品生产商必须证明配基不存在于药物底物原液中，或者其含量非常低，不被视为患者安全问题。当亲和填料在规模缩小的研究中显示成功时，应开始开发亲和配基的测定。一些开发定制亲和填料的公司开发了残留配基测定，作为cGMP 填料供应计划（Avitide，Repligen子公司）的一部分。

最终产品中可接受的配基水平基于分子结构、毒理学研究和预期的给药方案。还应该强调的是，任何脱落的配基都将通过后续的下游工艺单元操作（例如UF/DF、离子交换或疏水层析法）被去除或显著降低。表 2中比较了三种商业使用的亲和填料在捕获步骤后和药物底物中的残留脱落配基水平。

表 2. 三种生物工艺亲和层析填料在捕获步骤后产品池以及药物底物中测得的亲和配基脱落水平示例

考虑到亲和层析的所有优势、适合 I 期开发计划的开发和生产时间框架以及新的非 Mab 模式正在增加，可以预期定制亲和层析填料领域将经历实质性生长。相关技术，即配基发现、配基生产、特定固体支持物（如多孔基球或对流基质）都得到了很好的开发和理解。事实上，现在有多家公司已经提供专注于大规模定制亲和填料开发和供应的商业服务。表 3列出了在配基发现或填料开发和供应方面提供此类服务的公司，或两者兼而有之（注：表 3中列出的公司之间的合作伙伴关系可提供更广泛的服务）。

表 3. 为生物工艺应用提供定制设计亲和填料相关服务的公司列表