ADC已成为一类很有前途的抗肿瘤药物，目前已有十几种ADC药物获得批准，用于治疗多种类型的癌症患者。传统的 ADC 利用抗体赖氨酸的氨基或打开链间二硫键获得的半胱氨酸的巯基进行偶联，然而其均一性差，稳定性低，影响了药效及治疗窗口。为了改进这些问题，研究人员开发了各种特定部位的定点偶联方法。这些方法将细胞毒素或化疗药物偶联到抗体分子中特定的位置，例如半胱氨酸、谷氨酰胺、非天然氨基酸、短肽标签和多糖，从而制备均一度高，稳定性好，具有更好的活性和药代学特性的ADC。本文就四大类经典的定点偶联技术在 ADC 中的应用做一个简单介绍。

通过特定氨基酸实现位点特异性偶联

几种天然或工程改造的氨基酸，包括半胱氨酸和谷氨酰胺，被选作位点特异性的偶联位点。

THIOMAB技术是第一个对天然氨基酸进行修饰，将未配对的半胱氨酸进行位点特异性的方法。该方法将半胱氨酸残基插入抗体重链(HC)或轻链(LC)的不同位置进行偶联（图1）。由于工程半胱氨酸在表达过程中易被谷胱甘肽或其他覆盖，抗体需要部分还原以去除帽子。然后，使用硫醇-马来酰亚胺化学方法，将未封端的半胱氨酸与含有硫醇连接子进行反应。研究表明通过半胱氨酸残基(HC-A114C)的药物连接子偶联产生的ADC显示出近乎均一的偶联物，并且改善了治疗指数。例如，抗MUC16 TDC（THIOMAB-drug conjugate）在小鼠卵巢癌移植瘤模型中的体内效果比用传统半胱氨酸法制备的ADC在同等药物的剂量下药效提高了一倍。大鼠和食蟹猴对TDC的耐受剂量也高于常规ADC。

图1. THIOMAB技术产生的TDC

后续研究者开发了将药物连接子与抗体特定设计的半胱氨酸进行定点偶联的ADC。目前，多个位点特异性的ADC已进入临床，如SGN-CD19B、CD123A和CD352A（均为HC-S239C突变)；RG7861/DSTA4637S(LC-V205C突变)；IMGN632(S442C突变)；BAT8003(A114C突变)；以及基于双半胱氨酸突变的ADC，如PF-06804103(LC-K183C HC-K290C)。还开发了两种其他的技术，即半胱氨酸插入，如MEDI2228(HC-i239C)；以及HC-末端多肽融合，如ALT-P7(C-末端ACGHAACGHA融合)。然而，半胱氨酸工程抗体的使用并不能保证临床成功，一些已经放弃开发，例如，BAT8003和上面提到的Seagen的 三个ADC。

除了通过未配对的半胱氨酸偶联外，还发展了硫醇桥联方法。每个双功能药物连接子可以捕获两个游离的半胱氨酸硫醇基团，从而在所有八个链间二硫键完全还原后导致DAR4 ADC，异质性较低（图2）。例如，New Bio 的 NBT828。

图2. 双马来酰亚胺试剂交联半胱氨酸

谷氨酰胺通过位点特异性偶联也被报道。该方法不使用还原和氧化试剂，而是利用谷氨酰胺转氨酶(MTGase)将含胺的药物连接子或反应性spacer转移到HC-Q295脱糖抗体中（图3）。利用该技术的Innate ADC(IPH43)药物目前处于临床前阶段。

图3. 利用谷氨酰胺转氨酶(mTG)将含胺的药物连接子或反应性spacer转移到脱糖抗体中

通过非天然氨基酸实现位点特异性偶联

药物连接子与抗体中非天然氨基酸的偶联是另一种新型定点偶联产生匀质性ADC的方法。目前引入的非天然氨基酸通常为乙酰苯丙氨酸（pAF）、叠氮基甲基-L-苯基丙氨酸(pAMF)和叠氮赖氨酸（图4）。引入非天然氨基酸的抗体与药物连接子可定点、定量偶联，获得 DAR 均一、药效高、稳定性好、安全性高的 ADC，但也存在抗体表达困难，易产生免疫原性的弊端。

图4. 通过非天然氨基酸实现位点特异性ADC

Ambrx 公司的 ARX788 是首个利用非天然氨基酸开发的抗体偶联药物，目前处于临床研究阶段。ARX788选择的非天然氨基酸是乙酰苯丙氨酸（pAF），pAF上的酮基可与有效载荷AS269上的羟胺基团形成肟键，发生特异性位点的偶联，产生均质的ADC。

Sutro Biophma开发了一个无细胞蛋白表达系统，通过特定位置掺入p-叠氮甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)，适合于随后药物连接子点击化学的偶联以此制备ADC。由于无细胞蛋白表达的效率，进行了位点扫描以确定最佳偶联位置，目前已被用于各种ADC项目。例如， STRO-001（DAR2 ADC，HC-F404的偶联）、STRO-002（DAR4 ADC， HC-Y180 和 HC-F404 中的偶联）。

通过糖工程实现位点特异性偶联

通过将药物连接子与位于CH2结构域的N297糖链偶联，糖链介导的偶联提供了一种独特的位点特异性偶联方法。由于糖链的非还原末端存在几种不同的单糖，人们开发了不同的方法将药物连接子连接到这些糖上，包括岩藻糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和唾液酸(SA)。

Okeley等人报道了6-硫代果糖（一种岩藻糖类似物）可以通过代谢偶联到抗CD30或抗CD70抗体中。然后将抗体中的硫代果糖与含有MMAE药物连接子的马来酰亚胺偶联，DAR为1.3。硫代果糖产生的ADC保持了良好的血浆稳定性，并显示出较强的抗肿瘤活性。

半乳糖或半乳糖类似物也被通过半乳糖基转移酶引入。菌株促进的环炔与叠氮化物的环加成反应已被用于GlycoConnect，这是Synaffix开发的一项技术，其核心是将叠氮糖以酶促方式引入到天然抗体的多糖上。抗体首先在UDP 6-叠氮基GalNAc存在下经受内切糖苷酶和糖基转移酶(GalNAc-T) 两种酶的作用，以便将天然糖转化为均质的、截断的和叠氮标记的三糖(图5)。接下来，对叠氮标记的抗体进行药物连接子偶联，以产生均一的ADC。GlycoConnectt技术目前被用于三个临床ADC药物：ADCT-601(ADC Therapeutics)、XMT-1592(Mersana Therapeutics)和MRG004A(Miracogen)。

图5. UDP 6-叠氮基GalNAc存在下用内切糖苷和GalNAc-T进行多糖建模，通过连接有效载荷的无金属点击偶联获得均一的ADC

此外，也开发了利用唾液酸(SA)进行了位点特异性偶联的方法。SA首先被转移到抗体上，然后用高碘酸氧化以连接到含氨氧基的药物连接子（图6）。用此方法制备的抗HER2 ADC具有较强的体外和体内抗肿瘤活性。另一种类似的方法是通过无铜点击化学将C9-叠氮化SA转移到到抗体上，然后与含有细胞毒素的DBCO偶联。

图6. 利用唾液酸(SA)进行的位点特异性偶联反应

糖工程方法的独特之处在于，药物连接子与糖链偶联，而不需要设计氨基酸序列，并且它们连接在远离氨基酸残基的地方。然而，该方法需要糖工程所需的特殊试剂和酶。

通过短肽标签实现位点特异性偶联

目前开发了一些通过将细胞毒素与含有四到六个氨基酸残基的特定短肽标签偶联的位点特异性偶联方法。

Strop等人的研究将谷氨酰胺标签(LLQG)设计成抗体分子，标签中的谷氨酰胺可以被MTG识别以转移含胺药物。该研究证明，药物连接子MMAD可以通过酶有效地转移到谷氨酰胺标签上，包括C端重链上的LLQGA或C端轻链上的GGLLQGA。该ADC具有均一性的 DAR 2，展现了强效的抗肿瘤活性。

另一项研究通过使用转肽酶介导的转肽反应，产生位点特异性偶联的ADC。转肽酶的主要功能是帮助蛋白质附着到细菌细胞壁上，并组装菌毛。转肽酶作用于含有 C 端细胞壁分选信号的分泌蛋白，该信号含有一个五残基识别基序，例如 LPXTG，可以与特定的寡甘氨酸受体底物发生酰胺化反应 ，从而用受体的寡甘氨酸片段取代LPXTG的末端甘氨酸。这个方法已经用于产生ADC(图7)。例如，NBE Therapeutics公司利用这一方法，通过将LPETG标签融合到重链C-末端，然后与五甘氨酸修饰的细胞毒有效载荷PNU-159,682连接，开发了已经进入临床的ADCs 药物NBE-002。同样，GeneQuantum开发了基于重链 C 端 LPGTG 的GQ-1001药物。

图7. 转肽酶介导的Gly5-Linker有效载荷与C端LPXTG标记抗体的偶联

这类方法依赖于将独特的短肽标签引入抗体中进行酶修饰。虽然这类方法很简单，但这些短肽标签的潜在免疫原性目前尚不清楚，需要后续更多的临床验证。

小编小结

通过将细胞毒素或化疗药物与工程特定的氨基酸、非天然氨基酸、短肽标签和N297多糖偶联，研究人员开发了下一代位点特异性偶联技术。这些方法产生的ADC具有高度均一性，保证了生产过程批次间的重现性，与传统的偶联物相比具有更高的治疗指数。毫无疑问，这些新型技术未来将会为ADC药物更多的突破和成功发挥重要作用。

参考文献

1.Site-Specific Antibody Conjugation for ADC and Beyond.

2.Chemical Linkers in Antibody–Drug Conjugates (ADCs).

3.Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index.

4.Site-Specific Antibody−Drug Conjugation through Glycoengineering.

5.Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index.

6.Enzymatic Antibody Modification by Bacterial Transglutaminase.

7.Transglutaminase-Based Chemo-Enzymatic Conjugation Approach Yields Homogeneous Antibody−Drug Conjugates

8.凯莱英药闻公众号