预防性mRNA疫苗应对新发传染病以及病原体变异展现出显著优势，由于其结构简单、能够快速构建，加之“平台技术”的加持，现已成为疫苗研发的前沿技术，引发各界的广泛关注。RNA的免疫刺激作用早在20世纪60年代初就已为人所知，但直到1990年直接注射“裸”核酸后，即将体外转录的信使RNA（mRNA）直接注入体内，短暂性地让基因表达抗原蛋白的可能性才被证实。随着mRNA的稳定性的改进，包括RNA生产可行性的增加以及伴随的炎症反应的减少，mRNA疫苗和治疗方法的开发取得了重大进展。目前，除新冠疫苗外，利用mRNA技术制备的狂犬、寨卡、人巨细胞病毒等传染病预防性疫苗已经开展临床试验。

本文基于已上市mRNA疫苗技术特点，结合WHO最新发布的《预防传染病mRNA疫苗质量、安全及有效性评价法规考虑》（Evaluation of the QualitySafety and Efficacy of Messenger RNA Vaccines forthe Prevention of Infectious Diseases: RegulatoryConsiderations），探究mRNA疫苗在非临床研究和评价中的关键要点。

一、mRNA疫苗的主要特点

mRNA疫苗研发速度快。目前，广泛用于预防新冠病毒的mRNA主要采用一种新型的无细胞的酶工艺方式合成，通过使用DNA依赖的RNA聚合酶（如T7、T3或Sp6噬菌体RNA聚合酶）和核苷三磷酸或修饰的核苷三磷酸，在体外由线性DNA模板合成。在标准化和规定的条件下，无细胞体外合成技术能够实现mRNA疫苗相对快速的设计和直接大规模生产。相比于传统疫苗往往需要数年时间才能完成的产品开发，mRNA疫苗在应对突发公共卫生事件的快速响应能力，使其未来在传染病预防中将发挥重要作用。

需要特定的递送载体。首先，mRNA极不稳定，易被免疫细胞吞噬或被核酸酶降解；其次，mRNA分子量大（104~106 Da）且在生理pH条件下带负电荷，难以跨过同为负电荷的细胞膜。此外，为避免被溶酶体分解，mRNA被细胞摄取进入体内后必须及时释放到细胞质中。目前，新冠mRNA疫苗开发中，进展最快的递送载体是基于脂质的纳米颗粒（LNP）。

具有明显的免疫保护力优势。mRNA疫苗的免疫原理是通过特定的递送系统将表达抗原的mRNA导入体内，在体内表达出蛋白并刺激机体产生获得性免疫应答，从而使机体获得免疫保护。相比于传统灭活疫苗直接将抗原蛋白注射进入人体引起免疫应答的方式，mRNA在进入细胞质内后能够持续表达抗原蛋白，直至其被降解，同时细胞免疫和体液免疫的双重机制，使mRNA疫苗所介导的获得性免疫应答持续时间更长、免疫记忆更强烈。

具有佐剂效应。不同于DNA的双链结构，RNA通常以单链（ssRNA）存在，但RNA也能形成由短双链片段和中间各种单链环组成的复杂结构。这些RNA作为某些RNA病毒基因组的一种呈现形式，会被细胞内的模式识别受体感知，激活对病毒感染的固有免疫应答，这些固有免疫应答对于激活获得性免疫应答，特别是细胞免疫应答十分关键。此外，LNPs根据其成分也可能具有免疫调节作用。

基于mRNA平台技术。“平台技术”广义上指使用相同的基本成分作为主干，可通过插入新的基因或蛋白质序列来构建针对不同病原体的系统，疫苗平台技术是由流行病防范创新联盟于2017年提出，旨在促使疫苗迅速发展。使用“平台技术”开发新候选疫苗的意义是，此前获得的经验和信息，包括生产、质量控制、稳定性和非临床数据等都可以作为支持性数据，用于更快速地评价和开发新的候选疫苗。此外，平台技术提供的关于安全起始剂量或可耐受剂量方面的临床和非临床数据也可支持启动新候选疫苗的临床试验。

二、mRNA疫苗非临床评价中的特别考虑要点

对药效学研究设计的考虑。一是关注免疫应答的持久性或具有持久性的免疫细胞表型。在非临床研究中，免疫原性试验考察疫苗在动物体内引起的与人体相关的免疫应答。mRNA翻译的抗原片段分别递呈给CD4+T、CD8+T细胞或者通过释放被B细胞识别，最终激活细胞免疫和体液免疫，产生免疫抗体，但随着时间的推移，疫苗激发的免疫应答水平会逐渐下降，因此，需要关注免疫应答的持久性或具有持久性的免疫细胞表型，特别是被认为与候选疫苗诱导保护作用相关的免疫应答持久性，这对于评估后续剂量的需求（或时间）至关重要。二是关注Ⅰ型干扰素介导的固有免疫应答。过多Ⅰ型干扰素会导致免疫应答终止，为确保疫苗接种的有效性，应关注Ⅰ型干扰素介导的固有免疫应答并对其合理调控，目前所采取的方法主要通过使用自然修饰的核苷如假尿苷或N1-甲基假尿苷来代替尿苷，可以有效降低宿主的病原模式识别受体对mRNA分子的甄别能力。

对动物模型中安全性/毒性研究设计的考虑。一是mRNA和LNPs的生物分布和持久性。传统的在动物模型中的毒性试验往往具有局限性，不能准确推断一些不良事件的关联因素。为此，WHO建议可通过确定mRNA和LNPs（或脂质成分）是否会从接种疫苗的组织中分散出去、分布到哪些组织、所持续时间等，来展开对疫苗安全性的评价。二是全身和局部的毒性和炎症反应。RNA通过多种途径引发炎症反应，特别是通过固有免疫系统及其众多的RNA传感器引发。尽管其中一些活性可能有利于疫苗的免疫应答，但重要的是要监测全身和局部的毒性和炎症反应，以了解所有免疫应答、反应原性或毒性，这些将是预测人类严重不良事件或特别关注的不良事件的免疫指标。三是非自然修饰核苷的非预期和严重毒性。一些抗病毒药物和抗癌药物中，含有特定的非自然核苷类似物，它们的构象发生了改变，产生了线粒体毒性，从而导致了肌病、多发性神经病变、乳酸酸中毒、肝脂肪变性、胰腺炎、脂肪代谢障碍，甚至死亡。然而，这些临床观察到的毒性并没有在非临床动物模型中发现。因此，特别是对于含有非自然修饰核苷mRNA疫苗，这些修饰在其他已开发的核酸产品中并没有被完全表征，在安全性评价中，应仔细考虑如何在合适的动物模型和非临床研究中观察到这些潜在的毒性。

对脂质纳米递送系统中新型脂质毒性的考虑。两款mRNA COVID-19疫苗中的LNP均由中性磷脂、胆固醇、聚乙二醇-脂质和可电离的阳离子脂质4个主要成分组成。目前针对LNP的研发焦点主要针对可电离的阳离子脂质的优化。不同类型的脂质成分会导致LNPs的理化属性，如颗粒大小、形态、封装效率和表面电荷的差异，进而导致不同的安全性，与此同时，当各种脂质的比例发生变化时，LNPs的理化属性也会改变，因此当LNPs由新型脂质制成或其自身被修饰（例如改变比率或更改工艺），且此前未进行过非临床和临床测试，则需要对包含的新型脂质的材料单独开展毒性研究，并关注其遗传毒性、生殖毒性等。

对mRNA疫苗的遗传风险的考虑。对质粒DNA疫苗开发中疫苗核酸可能整合到宿主基因组的担忧，此前普遍观点（包括WHO）认为该担忧并不适用于mRNA疫苗，无需开展非临床研究解决，但近期针对BNT162b2的研究发现，BNT162b2激活并增加了人体细胞内的自主逆转录转座子LINE-1基因的表达，而LINE-1作为细胞内源性逆转录酶，能够介导RNA在肝细胞系Huh 7中被逆转录为DNA，这一发现可能导致需要重新审视mRNA疫苗的整合或遗传风险，对于这些逆转录产生的DNA是否会整合到细胞基因组中，未来可能还需要设计相应研究，如对疫苗接种的人体组织/细胞进行全基因组测序，明确其对基因组完整性的影响。

对mRNA平台技术的考虑。WHO认为当新的候选疫苗是基于特定生产商的平台技术，特别是在公共卫生突发事件期间优先病原体疫苗快速开发的情况下，可考虑对非临床方案进行简化。例如，与监管当局达成共识后，基于同一平台的临床数据或非临床安全数据的类似候选疫苗，可以简化或免除进一步非临床安全性研究。同样，同一平台中当使用具有相同摩尔数和mRNA-脂质比的LNP时，且多价疫苗中所含mRNA总量不超过单价制剂非临床安全性研究中的最高安全剂量时，单价疫苗的非临床安全性数据（临床数据）也可以支持多价疫苗或联合疫苗的临床开发。在该过程中，应始终考虑已知相关产品和已评价产品情况，特别是在基于同一平台技术的情况下，如有相关产品的临床数据，在评价候选疫苗在人体中的安全性时，可能比任何指定动物模型或体外人体模型中获得的数据更有意义。

鉴于当前新冠大流行以及新冠mRNA疫苗的研发速度，WHO发布的《预防传染病mRNA疫苗质量、安全及有效性评价法规考虑》为监管机构评价mRNA疫苗安全性及有效性提供了指导，具有重要意义。WHO认为，在mRNA疫苗非临床研究设计和评价中需要特别关注免疫应答的持久性或持久性免疫细胞表型、Ⅰ型干扰素介导的固有免疫应答情况、mRNA和LNPs的生物分布和持久性、全身和局部的毒性和炎症反应、非自然修饰核苷的潜在毒性、脂质纳米递送系统中新型脂质的毒性等方面问题。虽然这些问题并非与所有mRNA疫苗都存在必然联系，但疫苗开发者或生产商有必要对其加以验证，以便更好地了解候选疫苗的安全性和有效性。此外，应该认识到，mRNA疫苗介导免疫原性的类型和数量仍未研究透彻，其安全性也需要更长的时间观察，要想成功、广泛适用和持久有效地预防目标疾病，每种疫苗都要从其收益和风险角度进行评估。