近期，中国医学科学院整形外科医院蒋海越教授/刘霞研究员团队和上海交通大学医学院附属第九人民医院周广东教授团队在科爱出版创办的期刊Bioactive Materials上联合发表研究论文：研制了一种基于软骨脱细胞基质的光敏多孔仿生生物墨水，并实现了耳廓软骨的3D生物打印和体内再生，为个性化耳廓形态软骨的制备和再生提供了新材料和新方法。

01研究内容简介

耳廓作为人体面部的主要特征之一，耳廓发育畸形或缺损会严重影响患者的外观及功能，对患者的身心健康造成严重影响。临床常用的耳重建方法主要是自体肋软骨耳支架，但存在创伤较大、对术者耳支架雕刻技术要求较高，且有并发气胸和胸骨畸形的可能性。组织工程技术为耳廓重建提供了一种有前景的治疗策略，近年来，3D生物打印技术的兴起为组织工程提供了更加先进的手段。本研究团队针对传统水凝胶成分单一难以模拟软骨微环境，质地致密限制细胞行为以及力学性能差难以维持精确三维形态等技术瓶颈，研制了基于软骨脱细胞基质的光敏水凝胶（ACMMA）仿生软骨特异性微环境，应用聚环氧乙烷（PEO）产生微孔结构促进细胞行为和软骨形成，引入高强度和慢降解的聚己内酯（PCL）形成支撑框架，整合多喷嘴3D生物打印技术，精确控制载软骨细胞生物墨水和PCL的分布，制备了精确形态和良好力学性能的耳廓构建物，并在体内再生为形态保真度高、弹性好、有丰富的软骨特异性ECM沉积的成熟耳廓软骨样组织，为个性化耳廓形态软骨的制备和再生提供了新的策略。

Graphical Abstracts

一、软骨脱细胞基质光敏水凝胶的制备

ACM被认为是仿生软骨特异性微环境的最有前途的生物材料之一，因为其成分和组成与天然软骨相似。在本研究中，耳廓软骨通过脱细胞和酶消化策略制备成软骨脱细胞基质，定量结果证实了在去除细胞成分的同时，还保留了大部分的GAG和胶原成分。为了确定脱细胞程序后保留的ECM成分，对ACM和原生软骨进行了蛋白质组学分析，结果证实了ACM中保留了大部分的ECM成分并发挥了重要的生物学功能，而丢失的成分大多与细胞成分有关，这也进一步验证了脱细胞的有效性。此外，对不同蛋白质的功能富集分析为进一步复合和修饰以制备更理想的仿生材料提供了信息支撑，这也为ACM仿生材料在软骨组织工程中的应用潜力和优势提供了有力的证据支持。

Fig. 1. 软骨脱细胞基质的制备及蛋白组学分析

目前基于ACM的生物材料的可打印性和稳定性不足，这阻碍了3D生物打印的实际应用。为了满足生物打印的要求，通过MA修饰使其具备光固化性能，核磁氢谱和理化特性也进一步证实了MA的成功接枝，具备快速的光固化特性。然而，ACMMA水凝胶的可打印性和物理性能较差，导致结构稳定性和形状保真度有限。因此，加入了GelMA作为辅助材料，以平衡生物墨水的可打印性和稳定性，同时补充脱细胞过程中损失的一些胶原蛋白成分。最后优化生物墨水浓度和比例参数，平衡可打印性能和结构稳定性。

Fig. 2. 软骨脱细胞基质的甲基丙烯酸化机理和光交联过程

二、多孔生物墨水的理化特性

水凝胶类支架在交联固化后较为致密，会阻碍营养的交换而影响内部软骨组织的形成。鉴于这一点，本研究应用了多孔水凝胶的构建策略，如示意图所示，以水溶性的牺牲材料PEO作为占位而产生微孔结构，促进了营养的交换，进而有利于细胞的行为。PEO被添加到ACMMA/GelMA溶液中，导致ACMMA/GelMA和PEO水溶液的相分离，从而在去除未交联的PEO液滴后，在交联的ACMMA/GelMA水凝胶中产生孔隙。电镜检测观察到多孔结构，并进一步通过光镜、共聚焦、组织学等验证了水凝胶在正常培养条件下的孔隙结构。同时，流变测试结果显示， ACMMA/GelMA凝胶前体的粘度是可控的，并随着剪切率的增加而降低。这种剪切变稀的特性适合于打印含有活细胞的生物墨水，而不会影响细胞的存活。同时，水凝胶表现出对温度的高度敏感性，当温度达到凝胶化温度时，模量迅速增加，表明通过调整挤压压力、速率和温度，可以使其具备良好的打印性能，并适于打印活体组织或器官。

Fig. 3. 多孔水凝胶的物理化学性质.

三、多孔生物墨水的生物相容性

平衡墨水的可打印性和细胞行为一直是一个挑战，因为当细胞被嵌入密集的聚合物网络时，重要的细胞过程，如存活、迁移、增殖和ECM沉积会受到阻碍，但密集的网络通常有利于支持最佳的形状保真度和长期稳定性。为了验证多孔结构对细胞行为的影响，本研究进行了细胞迁移和增殖实验。迁移结果显示，多孔水凝胶组有大量细胞可以迁移到对侧，而对照组未观察到明显的细胞迁移。活/死细胞染色和DNA定量显示，多孔水凝胶组的细胞增殖要明显优于对照组。同时，Ki67免疫荧光和流式细胞周期分析也进一步证实了多孔结构有利于细胞的增殖，我们分析多孔结构更有利于营养物质和代谢废物的扩散和交换，从而促进细胞的活性和增殖。裸鼠体内实验证实多孔结构有利于细胞外基质的分泌和软骨组织形成。综合上述结果，证实了多孔水凝胶为细胞的生物活性提供了一个合适的三维微环境，更有利于细胞的迁移、增殖和基质分泌。

Fig. 5. 多孔水凝胶-软骨细胞构建物的体内软骨再生 

四、基于ACMMA多孔仿生生物墨水进行耳廓软骨的生物打印和再生

在成功制备基于软骨脱细胞基质多孔水凝胶后， 3D生物打印精确形态的耳廓构建物，回植裸鼠体内半年，形态维持满意，且去除外力时，能迅速恢复到原来的形态，表明其具有良好的弹性性能。进一步量化耳廓形态维持度，用Micro CT三维扫描再生耳廓软骨，通过三维重建与打印模型做偏差分析，形态相似性以偏差色谱的形式显示，在±1mm内的相似度达到86%。同时，组织学检测显示，耳廓构建物形成了成熟的软骨样组织，具有显著的软骨陷窝结构，以及丰富的GAG和II型胶原蛋白沉积。

Fig. 6. 基于ACMMA多孔生物墨水进行耳廓软骨的生物打印和再生.

五、基于ACMMA多孔仿生生物墨水和PCL内核支撑进行耳廓软骨的生物打印和再生

为了进一步提高构建物的机械强度，以达到更好地维持三维形态，引入了经FDA批准用于临床应用的高强度和慢速降解的PCL作为网格框架以提供足够的机械支持，保持更高的形态保真度。本研究应用多喷嘴3D生物打印机，在保证细胞高存活率的前提下，协调不同的喷嘴和材料的有序配合，以确保整体结构的稳定性。将人耳廓的三维数字模型设计成生物墨水和PCL交替排列的混合结构，保证每条PCL的两边都被生物墨水包裹，避免与体内组织直接接触。在逐层打印的过程中，每一层PCL沉积后静置10秒钟，待其冷却，再沉积生物墨水，以减少PCL高温造成的细胞损伤。此外，整体结构的稳定性主要取决于相交的PCL。由于PCL的疏水性，水凝胶不仅不能与PCL牢固结合，还会影响PCL线条之间的结合。因此，打印模型中的每条PCL线条需要打印两次，以确保每层PCL线条的高度超过水凝胶，从而保证层间PCL的牢固结合。经过一系列的参数优化，成功构建了复合PCL的耳廓构建物。在裸鼠体内也成功再生为耳廓软骨组织。值得注意的是，有PCL支持的再生耳廓软骨表现出足够的强度和刚度，难以被外力变形。三维重建的形态相似度结果显示，在±1mm内的相似度达到了94%，在±2mm内的相似度达到了98%。组织学显示，PCL的占位虽然影响了局部软骨的形成，但并不影响生物墨水区域的软骨形成。PCL的引入显著提高了耳廓结构的形态保真度，但唯一不足的是缓慢降解的PCL占位影响了工程软骨的整合，下一步为了同时保证力学性能和组织形成，PCL的比例和分布还需要进一步的探索和优化。

Fig. 7.基于ACMMA多孔生物墨水和PCL进行耳廓软骨3D生物打印和再生。

Fig. 8. 再生耳软骨的定量分析。

综上所述，本研究团队成功制备了基于软骨脱细胞基质的光敏多孔仿生生物墨水，应用多喷头3D生物打印技术，成功体外构建并在裸鼠体内再生出形态满意，力学良好的成熟耳廓软骨组织，为个性化耳廓形态软骨的制备和再生提供了新材料和新方法。后续将进一步优化耳廓构建的制备参数，并在大动物模型中进行验证，为患者个性化软骨构建及临床应用提供有效策略。