摘要

用于伤口的生物材料是一个活跃的研究领域。氧气在伤口愈合过程的几乎每个步骤中都起着关键作用，在这项研究中，一种产氧光合生物材料被进一步被修饰以释放其他生物活性分子。海藻酸盐水凝胶载有光合莱茵衣藻，在光照后可立即释放氧气。

此外，光合水凝胶在体外和体内均表现出高生物相容性。在20 名健康人上进行评估，结果显示该敷料无皮肤刺激，具有机械稳定性，且光合微藻可以正常存活。

该水凝胶还加载了基因工程微藻以释放人类 VEGF(血管内皮生长因子)，或预加载了抗生素。结果显示，这两种生物活性分子皆可持续释放。

这项工作中的光合水凝胶，可于局部提供氧气和其他生物活性分子，以加快伤口愈合。

背景

最近，在抗肿瘤治疗、中风和缺血治疗、器官保存和伤口愈合等多个医学领域，已经有建议使用光合微生物作为增加局部氧浓度的替代方法。在伤口愈合的情况下，在体外已证明，含有莱茵衣藻微藻细胞的支架可以减少组织缺氧，此外，基因工程制造的微藻和蓝藻或可在伤口处提供生物活性分子，如生长因子和糖胺聚糖。本研究团队开发了一种光合水凝胶伤口敷料，以向伤口释放氧气和其他生物活性分子。

研究结果

1、光合水凝胶的制备与表征

按照材料和方法部分(图1A)所述的方法制备光合水凝胶，形成具有均匀分布的微藻细胞的规则水凝胶网络(图1B)。此外，结果表明，结合单层无菌纱布，然后在2% CaCl2中浸泡水凝胶这一步骤，为材料提供了足够的强度和灵活性，使材料易于进一步操作(图1B)并具有良好的皮肤附着力。对新生产的光合水凝胶进行了代谢表征，在5∙107微藻/ml的条件下显示出最佳产氧能力。

结果表明，在无光条件下，氧气的消耗速率为 8.5 ± 2.1 nmol/cm2∙min，而在光照条件下，氧气的产生速率为11.2 ± 2.5 nmol/cm2(图1C)。在优化步骤中获得的初步数据显示，含有最低 (1∙107微藻/ml) 和最高 (2.5∙108微藻/ml) 微藻密度的水凝胶的氧合能力分别降低了 30% 和 70%。

图 光合水凝胶制造

 (A) 光合水凝胶是通过将无菌纱布与藻酸盐、微藻、CaCO3 和 GDL 结合并交联过夜制备的。接下来，浸入 CaCl2 中以改进材料的处理。(B) 图片显示出均匀的成分和柔韧性。(C) 黑暗或光照条件下的氧浓度演变（左）和水凝胶代谢率（右）。

研究了光合作用水凝胶(HG + C. reinhardtii)的结构和力学性能，并与不含微藻(HG)的对照水凝胶进行了比较。扫描电镜研究了水凝胶的微观结构，在这两种条件下都观察到具有高孔隙率的均匀聚合物排列(图2A)。SEM图像也证明了纱布层与聚合物结构融为一体，因为它完全嵌入在水凝胶中，而不影响藻酸盐交联模式(图2A，上图)。

此外，对照水凝胶的聚合物表面光滑，而光合作用水凝胶的聚合物表面粗糙，表明微藻完全被海藻酸盐包裹(图2A，下图)。定量分析表明，对照水凝胶和光合水凝胶的平均孔径相近，分别为252.9±8.5 μm和249.1 + 7.8 μm。孔隙分布也得到了类似的结果，但不受藻类存在的影响，两种水凝胶的孔隙分布范围在100 ~ 400 μm之间，最大频率在250 ~ 300 μm之间(图2B)。

此外，还研究了藻类对水凝胶膨胀能力的潜在影响，评估了它们在盐水中长达24小时的再水化力度。在对照和光合作用水凝胶之间没有观察到差异，在这两种情况下，都是作用4小时后达到最大膨胀能力，此时重量为其原始时的95%(图2C)。最后，通过单轴压缩试验研究水凝胶对机械力的影响，其中通过应力-应变曲线的线性回归分析量化压缩杨氏模量。结果再次表明，微藻的存在不影响水凝胶的杨氏模量，表明光合水凝胶具有与标准藻酸盐水凝胶相同的机械性能（图 2D）。

图 结构和机械特性

 (A) 水凝胶与微藻的成像。(B) HG 与 HG + C.r. 的孔比较。(C)在 30°C 下在 0.9% 的盐水中膨胀 24 小时的过程中，均为四小时后达到最大膨胀能力。

在7天的光照实验中，水凝胶持续保持稳定(图3A，俯视图)；此外，微藻也并没有入侵纱布层(图3A)，结果表明，光合水凝胶的释氧能力至少保持了7天(图3C)。

图 光合水凝胶的稳定性和功能随时间的变化

(A)水凝胶的光成像(上A)，微藻的完整性和分布(下A)。(B) 叶绿素含量和。(C) 产氧率

2、人体皮肤刺激试验

三名试验患者在任何时候都没有自我感受到疼痛与烧灼感。在 48 和 72 小时后，只有一名志愿者在控制点描述了心悸（图 5B）。回收应用后的水凝胶进行评估，并没有发现任何损坏，与应用前的质量相比，水凝胶显示出 60% 至 70% 的质量损失。

图 水凝胶在人类志愿者健康皮肤上的应用

(A) 使用时、去除后的0、24、72小时时使用水凝胶与含有微藻的水凝胶的患者前臂图像 。(B)志愿者在所有时间点完成对不同治疗部位疼痛强度(0-10)、瘙痒、灼烧感和心悸感觉(0-3)的自我评估。(C)水凝胶应用后，HG和HG + cr均恢复，以评估完整性(左)和质量减少(右)。(D)将微藻水凝胶镀于TAP琼脂中，评估应用后微藻的活力。

3、氧化能力和生物活性分子释放

将新鲜分离的小鼠皮肤与光合水凝胶放在一起，可发现氧气含量确实在上升。

图 光合水凝胶的氧合能力。

(A) 实验设置示意图。氧浓度在黑暗(I, DARK)或光明(II, light)中测量5分钟，同时存在斑马鱼(B,C)或皮肤外植体(D, E)。接下来，加入水凝胶，在有光(III, ON)或无光(IV, OFF)的情况下测量氧浓度10分钟。

水凝胶因其在原位释放生物活性分子的能力而被广泛使用，而转基因微藻曾被提议作为重组生长因子的局部释放工具。因此，我们用产生VEGF的微藻制备水凝胶，并在一段时间后测量释放的重组分子的浓度，结果显示，在体外至少有7天的持续释放(图7A)。

此外，将对照(HG)或光合水凝胶(HG + C. 衣藻)加载头孢唑林并量化其累积释放量，各组间数据相似，在前2小时内达到约68%的药物释放量，8小时后达到75%，72小时后达到80%(图7B)。由于微藻可能会潜在地影响药物的生物活性，因此在对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行培养的生长抑制试验中测定了其抗菌能力。

结果表明，HG和HG + C. reinhardtii在8小时和72小时后释放的头孢唑林与新鲜制备的抗生素(对照)一样有效，而光合作用或对照水凝胶本身没有抗菌作用(图7C)。

图 重组生长因子和抗生素释放

(A)用转基因微藻制备的水凝胶在制备0、3和7天后定量释放VEGF。(B)对照水凝胶或加载了1%头孢唑林(总8 mg)的光合水凝胶，在0.9%生理盐水中定量累积释放长达72小时。

讨论

莱茵衣藻是一种在作用于人体时显示临床安全性的光合微生物。它还具有强机械性，并可以吸收伤口渗出的液体。本研究中的光合水凝胶还具有持续释放新产生的重组生长因子和生物活性药物的能力，如VEGF，这一物质对慢性伤口患者的康复非常重要。这些光合水凝胶展现出的优良特性，还需要进一步研究以评估其在相关临床前伤口模型（如糖尿病小鼠）和不同类型伤口的人类患者中的疗效。

国内也有多个科研团队在研究功能性伤口凝胶，我们团队也将会持续关注此领域研究的最新进展。