前言：行业内公认，X-射线衍射图谱（XRD）是确定多晶型最可靠的依据，XRD图谱也常被称为晶型的“指纹”。由于有机药物晶体峰位多且杂，重叠严重，严格意义上的单纯图谱比较，往往得出生产药品晶型与标准品完全不同的结论，这种图谱对比差异在原料药申报及研究生产过程中带来诸多困扰。因此需要根据研究目的，有策略的系统分析XRD图谱数据。
XRD图谱分析中的主要问题
1、粉末衍射XRD图谱与标准图谱比对
涉及到晶型的原料药申报和研究生产中，均需要与标准品或者理论图谱比较，粉末X-射线衍射仪测试后处理得到的XRD数据分为以下三类：（标准图谱的获取方式详见20201215期推文：《被忽略的“XRD标准谱”的获取技巧》）。
（1）2θ角度和晶面间距（d值）确定多晶型类型，是药物API中原子和分子的排列方式及位置信息；是晶型的特征信息。
（2）峰高度（Hight）、峰强度（Int.I）、相对峰强度（Rel.int.）是晶型中不同晶面分布的统计，是样品晶型的特征信息，也是晶型定量分析的基础。
（3）半峰宽（FWHM）表征衍射峰的峰形，反映多晶体晶粒尺寸、外形、尺寸分布等性质，不作为晶型的特征信息。
药物晶型研究中，最常用的是通过2θ（或d-spacing）与相对峰强度Rel.Int比较晶型的一致性。但由于峰强度受样品制备、测试条件、仪器等影响较大，对于原料药申报等重要图谱比对和晶型定量分析中，则需要单独开发样品制备、测试等方法，保证样品峰位置和峰强度的可重现性。对于需要兼顾效率的批次图谱的对比：如专利晶型确定、晶型筛选等，大家公认：（1）粉末XRD图谱的峰位置（或者晶面间距d值）有时比强度更重要；（2）药物晶体中低角度的数据比高角度数据更重要；(3)有机药物晶体在40°以上基本无鉴别意义的衍射峰（晶面间的距离越大，角度越小，晶面上的原子排列越密集）。
2、峰缺失和衍射峰强度次序变化
晶型相关研究及实践过程中，经常会遇到PXRD图谱少量峰缺失，峰强度不一致的情形，对于遇到这类问题，常结合热分析DSC/TGA、固体红外、拉曼等辅助数据判断其是否为新晶型，同一晶型出现峰的缺失和衍射峰强度次序变化有以下几种可能原因：
(1)“晶体粒度”的影响
利福平晶型II样品，依次经过30、60、120、200目的筛子后测试粉末衍射图谱，发现同一样品，过筛为不同粒度级别的样品进行测试，得到的XRD图谱峰强度及强度次序发生明显变化，并且局部放大图显示，过30目筛子(0.6mm)的谱图,存在明显的“峰缺失”(图2框线标注部分)，如下图1/2所示：
图1利福平同一样品过不同筛目后，XRD图谱峰强度差异巨大
图2利福平同一样品过不同筛目后，XRD图谱局部放大图显示部分峰的缺失示意图
晶型粒度对“峰缺失”和峰强度影响原因：衍射强度本质是对不同晶面分布的统计。因此XRD测试中，理论上1cm2的面积上要有超过1100万个衍射数据才具有统计的意义。我们常用的X-射线粉末衍射仪，测试的样品对象是“一堆多晶粉末”，且其中的每一粒粉末都是“多晶体”。“多晶体”是由多个小晶体组成的晶体结构。每个小晶体（即单晶）的内部，晶格位向是均匀一致的，而各个小晶体之间，彼此的位向却不相同。粒度较大的“多晶”样品，内部小晶体间的各项异性导致不同粒度产品峰强度差异显著，甚至出现少量峰缺失（即大家熟知的“择优取向”）。因此X-射线粉末衍射样品制备中，样品需要经过研磨处理，一般情况下，样品手感像面粉，有滑腻的感即可。而对于晶型含量的定性研究中，研磨样品需要过360目筛的粉末颗粒用于分析。
(2)制样过程“研磨”的影响
如前所述，通常对样品进行研磨降低大粒度样品“择优取向”的影响。但“研磨”有导致晶型转变（压力转晶）和结晶度降低的风险，从而导致不同程度的“峰缺失”或“峰强度”改变。如某一致性评价药品晶体，研磨2min、3min、4min的样品与研磨1min的样品对比，19.4°处（特征强峰）的峰缺失。又如图4布洛芬晶体，研磨前后，峰强度差异明显。
图3某一药物晶体不同研磨时间的XRD放大图谱
图4布洛芬研磨前后以及单晶模拟的XRD图及差异图表
（3）晶体形貌的影响
对于“薄片状”和“细长针状”形貌的晶体，特点是长径比非常大。采用压片法制样，几乎无法消除择优取向的影响。测试得到的图谱特定晶面峰缺失严重，峰强度重复性差。特殊装样方法：如撒样或侧法装样，是这类特殊晶体形貌样品得到可重复图谱的关键。
（4）样品试片平面的影响
试片表面形状不规则、毛糙、向上或向下凹凸等，会引起XRD衍射图谱峰的宽化、峰位置的位移、衍射峰强度重现性差。制样过程中，要求轻轻压片磨平。
此外，粉末XRD的峰位置、相对峰强度受洛伦兹极化、吸收、温度等的影响，衍射仪法的衍射峰相对强度公式如下：
在对晶型XRD强度允许的误差范围是5%；峰位置的偏差限度为±0.2°。因此对于定量分析及重要批次的图谱重复性，在设备、制样等一致情况下，满足上述2θ±0.2°，峰强度5%限度要求。
3、峰形:半高宽、峰对称性
完美晶体（理想晶体）的衍射峰形为一条直线，而实际晶体衍射峰有一定的宽度；在衍射强度一半的高度对应的一个峰形的半宽高（B），如下图5所示。
图5 （a）实际晶体的衍射峰形；（b）理想晶体的衍射峰形
衍射峰的峰宽受三个因素的影响：仪器本身造成的固有宽度、晶格畸变引起的宽化和晶粒尺寸影响。这三部分对衍射峰峰形的影响并不是简单的累加作用，而是一种“卷积”关系。晶体XRD图谱的峰形不作为晶型的特征信息。
4、结晶度与无定形混晶的区分
结晶度的概念来源于材料领域，是用来表示聚合物中结晶区域所占的比例。图7药物晶体领域结晶度的示意图，药物晶型结晶度类似表示晶体结晶区域的比例。即分子层面晶体的排列方式是一致的（晶型一致，因为晶型的定义即是分子的排列方式），但排列“紧密程度”存在区别，导致晶型结晶度的不一致。
图6 药物晶型结晶度示意图
图7 标示“mixed system”的XRD图谱，可能是混有一定量的无定形，但也可能
是同一种晶型，只是结晶工艺的差异，得到的同一种晶型结晶度有差异。
图7 结晶度or无定形混晶的XRD示意图
5、2θ角度与晶面间距d相互转换
晶型相关专利及文献中，经常会随机的只给出2θ角度值或者晶面间距d值，类似情况经常需要我们通过布拉格公式进行换算。2θ角度和晶面间距满足拉格定律：2dsinθ=n*λ（d为平行原子平面的间距，λ为入射波波长，θ为入射光与晶面之夹角，n为衍射级数），即二者之间数据可以互换计算。X射线入射波长是通过滤波镜的单色光（特定波长）即λ为定值：药物晶体最常使用的cu靶X射线波长为1.5406；n为衍射级数，XRD衍射中，级数为1；根据布拉格定理，相互换算计算方式如图所示：
图8 2θ角度与晶面间距d相互转换晶的计算方法
小结：药物晶体X-射线衍射技术主要包括单晶X-射线衍射技术和粉末X射线衍射技术。单晶X射线衍射技术本身可以单独完成结构、组分、含量、构型晶型等各类分析，它技术难度在于获取可解析的单晶。而粉末X射线衍射图谱，主要用于多晶形态的识别，测试结果影响因素较大，技术难点在于有策略的、系统的分析图谱。
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