近期，上海市第九人民医院眼科阮静副研究员和新加坡A*STAR材料和工程研究所（IMRE）Xian Jun Loh教授合作在期刊 Bioactive Materials 上发表研究论文。该研究设计了一种可用于骨修复及监测的活性传感支架，该支架材料具有远期骨诱导活性和近期电化学传感特性，为骨组织再生、早期监测和疗效评价提供了新的科研思路。
1、研究内容简介
严重创伤、手术切除和先天性畸形导致的骨缺损修复在临床上仍然具有挑战性。近年来，已经开发出多种作为骨再生的支架替代物的新材料。然而，新骨再生率和支架降解率之间的不匹配仍是骨缺损修复中一大难题。此外，在复杂的生理环境下，来自不同供体的种子细胞的增殖能力和成骨潜能存在显著差异。因此，监测骨再生过程中的组织矿化程度对于评估骨修复效果至关重要。
近来，电化学传感器在细胞与界面之间相互作用的连续监测应用中受到广泛关注。碳纳米管（Carbon nanotubes，CNT）由于具有高比表面积、良好导电性和π-π共轭作用，已被广泛用于电化学生物传感器的制备。同时，CNT还具有良好的成骨诱导活性和传导活性。然而，考虑到CNT作为生物支架首先应具有良好的生物相容性，研究团队将CNT进行羧基化改性后与生物大分子壳聚糖（CMC）进行交联固化，制备了一种具有三维多孔结构的电化学传感生物活性支架（CNT/CMC支架），该支架在兼具良好生物相容性和骨诱导活性的基础上，CNT 化学结构表面依然可通过C-C之间的离域π键表现出良好的电化学传感特性 (图1)，相对于传统CT监测技术，该传感支架具有灵敏度高、检测方法简单的优势，可有效用于新骨再生和缺损修复的监测。
图1 智能活性支架实现骨修复及监测的原理示意图
该研究开发的支架材料是基于多位点化学交联反应制备，具有三维多孔连通结构，相较于单纯CMC支架，CNT/CMC支架具有更高的孔隙率和力学强度。同时稳定的共价交联作用和空间位阻效应也赋予了CNT/CMC支架具有降解可控性，在加速降解实验中，15天降解率约达50%，相对于CMC支架，降解速率得到有效控制（图2）。
图2 CNT/CMC支架的微观形态、力学性能及降解性能
研究通过细胞增殖、细胞活-死染色、蛋白定量及qPCR等方法优化了支架材料中羧化CNT的最佳比例。当CNT含量为0.5%时该支架具有较好的细胞相容性（图3 a,b）；扫描电镜显示干细胞于CNT周围融合生长、附着于支架孔隙结构中(图3 c）。同时，通过定量检测早期成骨相关蛋白ALP以及早期成骨相关基因ALP, BSP, Col1A1, OCN 及OSX，发现CNT含量为0.5%的支架具有最优的骨向诱导活性（图3 d-i）。
图3 CNT/CMC支架细胞相容性及成骨诱导活性优化
研究团队进一步评价了CNT/CMC支架材料体外成骨诱导活性，发现CNT/CMC支架组成骨相关基因（ALP, BSP, Col-1 及Runx2）的mRNA表达水平（图4 a-d）和成骨相关标志蛋白（Col1A1, Runx2, OPN, BSP, OSX及OCN）的表达水平（图4 e-f）均显著升高，并且细胞水平的成骨外基质（ALP、ARS）染色结果也验证了这一结论（图4 g-h）。而添加了生长因子BMP2的CNT/CMC/BMP2组短期内也表现出优异的骨诱导活性，一定程度上说明CNT/CMC支架具有良好的生物相容性。同样中长期内，CNT/CMC支架的骨修复效果在大鼠颅骨标准骨缺损模型中也进行了系统评估，Micro-CT显示植入CNT/CMC及CNT/CMC/BMP2支架后大鼠颅骨缺损修复程度比空白及CMC支架对照组有明显提高，骨体积/组织体积、骨小梁数目、骨密度检测也证实CNT/CMC及CNT/CMC/BMP2支架具有更好的中长期成骨诱导活性（图5a-d）。CNT/CMC支架在植入大鼠颅骨缺损后不同时间分别进行了四环素、茜素红、钙黄绿素荧光染色，并且植入8周后进行行硬组织切片和胶原纤维组织学染色，综合评估新生骨形成情况，组织水平的定量分析结果提示CNT/CMC具有良好的促成骨性能（图5 e-i）。
图4 CNT/CMC支架体外成骨诱导活性
图5 CNT/CMC体内成骨诱导活性
最后，研究团队系统评估了CNT/CMC支架对新骨再生过程中成骨分子标志物ALP和矿化程度的电化学响应性能。体外检测原理利用ALP可将电化学惰性的4-氨基苯基磷酸盐钠盐水合物（pAPP）催化形成具有氧化还原性的对氨基苯酚（pAP）从而产生电化学响应信号，将接种干细胞分别培养2、5、10天的CNT/CMC支架于pAPP溶液中测定循环伏安（CV）曲线，发现随培养时间延长，电化学响应信号越高，反映成骨标志物ALP生成量逐渐增加 （图6a-d），CV曲线信号增强。随着细胞骨向分化程度增加，矿化基质沉积于支架表面，导致CNT/CMC支架电阻增加，导电性能下降，从而引起CV曲线信号减弱。利用这一变化趋势，研究团队在体外（图6 e-j）及大鼠体内（图7）分别验证了CV曲线信号用于监测CNT/CMC支架促新骨再生情况，结果表明，CNT/CMC支架在体外可检测成骨分子标志物ALP低至0.2unit/mL, 在体内可从第一周开始监控新骨矿化程度。
图6 CNT/CMC支架体外成骨诱导电化学响应
图7 CNT/CMC支架体内成骨诱导电化学响应
总体而言，该研究团队设计开发了一种新型CNT/CMC化学传感活性支架，该支架可联合生长因子BMP2诱导活性和CNT传导活性有效促进新骨再生，并且该传感支架也可以通过电化学检测方法有效评估细胞骨向分化和新骨矿化程度，为骨组织再生修复过程中的早期、灵敏检测奠定了研究基础。
2、原文信息
Huang Y, Zhang L, Ji Y, Deng H, Long M, Ge S, Su Y, Chan SY, Loh XJ, Zhuang A, Ruan J.
A non-invasive smart scaffold for bone repair and monitoring.
Bioactive Materials. 19 (2023) 499-510.
