第三节 湿热灭菌程序开发（一）

 

1、热力灭菌设备

 

热力灭菌设备分为湿热灭菌设备和干热灭菌设备。

 

湿热灭菌设备：按灭菌介质不同分为饱和蒸汽灭菌设备和空气加压灭菌设备。

 

饱和蒸汽灭菌设备：脉动真空蒸汽灭菌柜、重力置换蒸汽灭菌柜，带灭菌功能的胶塞清洗机、在线灭菌系统（如罐体及冻干机SIP功能）

 

空气加压灭菌设备：蒸汽-空气混合灭菌柜，过热水灭菌柜。

 

干热灭菌设备：按使用方式可分为间歇式和连续式。

 

间歇式干热灭菌设备：如干热灭菌柜，用于金属器具、设备部件灭菌及除热原。

 

 

连续式干热灭菌设备：如隧道烘箱，用于安瓶瓶或因林瓶灭菌及除热原。

 

2、湿热灭菌程序的开发

 

为了满足特定物品的无菌要求和质量稳定性，有必要开发与被灭菌物品相适应的湿热灭菌程序，灭菌程序的开发是确定灭菌工艺的各项物理参数的过程。灭菌程序的开发应列入正式的开发计划并有相应的文件和记录。本节将以湿热灭菌柜为例进行湿热灭菌程序的开发，图2是PDA湿热灭菌方法选择决策树，对程序的开发有着指导作用。

 

 

图2 PDA湿热灭菌方法选择决策树

 

2.1设计灭菌方法

 

灭菌程序设计方法主要有两种：过度杀灭法和残存概率法。两种方法都可以使被灭菌物品达到相同的无菌保证水平，选择哪种设计方法很大程度上取决于被灭菌物品的热稳定性。过度灭杀法要求的热能较大，被灭菌物品降解的可能性较大；残存概率法要求的热能较小，有利于被灭菌物品的稳定性。

 

过度杀灭法

 

过度杀灭法的目标是确保灭菌程序赋予被灭菌物品达到一定程度的无菌保证水平，而不管被灭菌品在灭菌前的微生物含量以及污染菌的耐热性。设计过度杀灭法时，通常假设初始菌的数量及其耐热参数如下：

 

N0=106，D121℃=1分钟，z=10℃

 

为了达到微生物残存概率为一百万分之一，NF=10-6

 

利用上面的以上数值，可以计算出达到设计要求的FPHY和FBIO如下：

 

F0＝FPHY＝FBIO＝D121℃×（LogN0－Log NF）＝12分钟

 

因此一个用过度杀灭法设计的灭菌程序可以定义为“一个被灭菌品获得的F0至少为12分钟的灭菌程序”。欧盟在最终灭菌制剂的法规中，将对过度杀灭定义为“湿热灭菌121℃下15 分钟”

 

在自然环境中，很少发现微生物的D121℃超过0.5分钟。在过度杀灭法中所假设的污染菌含量及其耐热性都高于实际数。在过度杀灭设计法中，由于该方法已经对微生物含量及耐热性作了最大程度的估计，因此从无菌保证的设计角度看，没必要对被灭菌品进行常规的灭菌前污染菌监控。

 

残存概率法

 

不耐热产品或物品的灭菌不能使用过度杀灭法，这就需要所建立的灭菌程序必须能恰当地杀灭微生物，但不能导致产品或物品的降解。这样的灭菌周期的建立有赖于研究产品或物品上的微生物数量和耐热性。一旦确定了微生物的数量和耐热性，就可以设计出一个能达到SAL小于10-6的灭菌程序。

 

残存概率法设计时，N0和DT的取值是基于产品或物品在灭菌前污染菌含量检测数据，另需加上安全余地，它取决于以下方面：

 

专业判断

 

生物负荷数据的范围

 

对产品生物负荷常规测试的程度

 

按GMP规范生产的产品，实际微生物初始数量应该很低，通常每个容器1-100个菌。通常说来，只有环境中形成的芽孢或从产品分离的芽孢才需要测试D值。将产品在80-100℃下加热10-15分钟，可以筛选掉耐热性差的微生物。DT值的选择应将初始微生物试验中检出的最耐热菌的安全系数考虑在内。所选定的安全系数反过来又与初始微生物的数量和耐热性测试的频率和程度相关。

 

假设产品的生物负荷测试中：

 

N0＝102

 

D121℃＝1分钟

 

Z＝10℃ 

 

利用以上数值，可以计算出经121℃灭菌，微生物残存概率小于10-6所需的FPHY和FBIO如下：

 

F0＝FPHY＝FBIO＝D121℃×（LogN0－Log NF）＝8分钟

 

残存概率法设计的灭菌工艺，通常要求对每批产品灭菌前进行微生物含量及耐热性测试，积累微生物污染的数据。如果长期以来的数据证明在实际的GMP控制条件下，污染水平很低，且检不到耐热菌，污染菌监控的方案可作适当调整。

 

2.2确定装载类型

 

灭菌工艺开发的下一个步骤是确定灭菌物品的种类，确定装载类型。灭菌物品通常划分为多孔/坚硬装载和液体装载。不同装载类型应选择合适的灭菌方法。

 

多孔/坚硬装载

 

多孔/坚硬装载是指直接接触饱和蒸汽来实现灭菌的物品。当蒸汽在被灭菌物品的表面冷凝时，发生热量转移。多孔/固体物品包括但不局限于下述内容：

 

过滤器（薄膜式过滤器、筒式过滤器、预过滤器等）

 

胶塞和其它聚合物密封件

 

管道和软管

 

工作服

 

清洁设备

 

设备部件

 

液体装载

 

液体装载的灭菌通过传导和(或)对流作用，将能量传递给容器中的内容物。液体装载包括但不局限于以下内容：

 

最终容器（如小瓶、袋、瓶子、针筒或安瓿）的药液（溶液、悬浮液和/或乳剂）

 

实验后或生产后需处理的含有潜在致病微生物的废液

 

第四节 湿热灭菌程序开发（二）

 

2.3选择灭菌程序

 

对于湿热灭菌来说，有两种常用的灭种程序：饱和蒸汽灭菌程序和空气加压灭菌程序。饱和蒸汽灭菌程序通常用于多孔/坚硬装载灭菌，空气加压灭菌程序通常用于液体装载灭菌。下面对这两种灭菌程序作简要介绍：

 

饱和蒸汽灭菌程序

 

按灭菌前排除空气的方式不同，饱和蒸汽灭菌程序分为脉动真空灭菌程序和重力置换灭菌程序。

 

脉动真空灭菌程序

 

脉动真空灭菌程序在灭菌前通过机械真空泵将空气从腔室中抽走，常用于难以去除空气的多孔/坚硬装载的灭菌，比如软管、过滤器和灌装机部件。灭菌程序开始之前，对装载的处理很重要。如果每次抽真空至0.1个大气压，那么每个脉冲（抽真空-充蒸汽）将使灭菌柜内的空气减少90%或者1个对数单位。三次脉冲可使灭菌柜内的空气下降3个对数单位，有效地将空气去除99.9%。为了使装载处于正常状态，可能另需正压脉冲（充蒸汽至高于大气压，避免空气进入腔室）。通过这个方法，提高去除空气的效率，缩短平衡时间。在制定灭菌程序时，要准确地确定脉冲的次数和类型。

 

重力置换灭菌程序

 

重力置换灭菌程序的原理在于灭菌柜腔室中的冷空气比进入的蒸汽重，冷空气被从腔室顶部输入的蒸汽往下排挤到腔室的底部，并通过腔室底部的排水管排出。蒸汽往往通过导流档板或散流器输至灭菌柜腔室。蒸汽注入腔室的速度非常关键，如果蒸汽进入过快或分布不合理，装载的顶部或周围可能会夹带空气层。如果进汽过于缓慢，空气受热而扩散入蒸汽中，从而使排除空气更加困难。

 

重力置换灭菌程序排除空气的效率低于脉动真空灭菌程序，对排气比较困难的装载而言，不建议采用这类灭菌程序。

 

空气加压灭菌程序

 

对于液体装载灭菌，液体容器顶部常留有小部分气体(空气、氮气或其他惰性气体)。当液体被加热时，顶部气体膨胀，容器中的压力随之增大。冷却阶段，容器内的温度高于容器外，容器内的压力也会比腔室内压力大。为保持容器的形状和密封完好性，需空气加压，增大腔室的压力，降低腔室和容器内的压差。加压灭菌程序通常采用无油压缩空气。通入腔室的空气须先经过除菌过滤器过滤。为防止加入冷空气会引起腔室内的温度波动，空气在通入腔室前要预热。常见的空气加压程序有蒸汽-空气混合灭菌程序（SAM）和过热水灭菌程序。

 

蒸汽-空气混合灭菌程序

 

程序以空气和蒸汽混合物为加热介质。当蒸汽中加入空气，产生高于一定温度下饱和蒸汽压的压力，这种灭菌程序即为蒸汽-空气混合灭菌程序。与饱和蒸汽灭菌相比，它的热传递速率低。灭菌结束后，常见的冷却方法是向灭菌柜夹套通入冷却水，保持空气循环冷却。也可通过在装载上方喷淋冷却水使其降温。

 

过热水灭菌程序

 

过热水灭菌程序是指在空气加压条件下，以过热水为加热介质进行灭菌。这个程序中，加压是为了保持水在高温下的液体状态。

 

2.4多孔/坚硬装载灭菌程序开发要素

 

多孔/坚硬装载灭菌重现性和获取无菌保证水平的最大风险是单个产品中可能夹带的空气，因此灭菌前，应确保充分地排除灭菌柜腔室和产品中的空气，同时灭菌过程确保向灭菌柜提供干饱和蒸汽。通常多孔/坚硬装载灭菌程序的开发需要从以下方面进行考虑：

 

装载最冷点

 

在腔室热穿透试验前进行热分布研究，画出装载的分布图，确定灭菌品中适当的监控点位置，确定装载中最难加热的部位。

 

装载的温度测试应取最难加热的物品（如质量大的、易包藏空气的、长的软管，或这类特性兼备的装载物品）。作温度分布图时，要比较装载类型对加热的影响（如比较排除空气的难易及大装载加热的难易程度）并将温度探头放置在最难加热的位置。

 

装载准备

 

多孔/坚硬装载的准备方式可有多种，包括但并不局限于以下示例：

 

用可穿透蒸汽和空气的包装材料将装载包扎（如不脱落纤维的纸或其他聚合包装材料）

 

加盖但不封闭的桶/盒（如带孔的不锈钢桶/盒)

 

将装载放在静止或旋转桶式的容器中（如胶塞）

 

无菌生产中所用的物品必须加以包装或包扎，以便在使用之前保持无菌状态。包装材料需考虑空气及冷凝水的排除，避免微生物污染。

 

装载方式

 

在运行确认后及性能确认前，要确认装载的类型和方式，并有相应记录。装载方式的确定应考虑以下方面：

 

装载不能接触腔室内壁。

 

尽可能减小金属容器平面间的接触以及与灭菌车之间的接触。

 

为方便去除空气及冷凝水，明确装载物的方位并有相应记录，如将桶倒置。

 

质量大的装载应放在腔室中较低的架子上，尽量减少冷凝水所致的装载潮湿。

 

控制灭菌柜中装载物的数量，如果预期装载物的量是变化的，则需确定最小和最大装载量。

 

如果确认表明物品的摆放位置不影响灭菌效果，那么装载方式是可变的。

 

应制定适当的SOP，便于相关操作人员执行操作。

 

运行参数

 

建立灭菌程序的关键要素是确定运行参数，以满足灭菌工艺设计的目标并确定它们属关键因素或重要因素。表1列出了建立多孔/坚硬装载灭菌程序参数时需要考虑的因素。

 

表1 多孔/坚硬装载灭菌程序主要参数

 

 

关键参数涉及产品的安全和有效性，关键参数不合格可能会导致灭菌的失败。重要参数保证日常灭菌运行处于“受控”状态，重要参数不合格时需调查并有文件证明对灭菌装载处理的合理性。

 

平衡时间

 

平衡时间表示去除空气并使装载达到灭菌条件的能力。即使最终达到了设定的灭菌温度，平衡时间的延长也表示去除空气或加热能力的不足。在程序开发中，尽可能减小平衡时间，采用以下方法可缩短平衡时间：

 

确认装载正确放置，有效排除空气（如胶管不受挤压）

 

增加真空或蒸汽正脉冲的次数

 

提高真空脉冲的真空度

 

优化装载方式

 

第五节 湿热灭菌程序开发（三）

 

2.5液体装载灭菌程序开发要素

 

封闭容器中液体的湿热灭菌，是通过加热介质将热能经内包装容器传递给容器内液体来实现的。在浸入-喷淋式灭菌柜中，可以使用过热水和压缩空气。这类灭菌方式通常不需要排除腔室中的空气就可进行灭菌，但一般要求加热/冷却介质强制循环，以促进物品加热/冷却过程中的热传递。

 

在建立最终灭菌产品的灭菌程序中，最需要关注的问题是保证装载中最低温度点获得足够的杀灭时间，又要保证装载中高温点的产品符合产品质量要求，灭菌程序开发时应注意以下方面：

 

在确认和常规灭菌过程中，装载物要处于相同的位置。

输入装载的热量应一致，不应过高或过低。

装载的生物负荷应符合设定标准。

有足够的空气增压值（如果是采用空气加压的程序），使容器的破损和变形降低到最小程度。

灭菌柜应控制产品的冷却速率，避免产品的爆裂。

生物指示剂在产品中的耐热性。

应根据加热介质的类型（饱和蒸汽、蒸汽-空气混合物或过热水）和液体容器的类型（如玻璃容器、软袋、塑瓶）设计灭菌柜的托盘/架子。

每种容器及装载规格均应通过热穿透试验来确认装载的冷区及热区。通常液体装载灭菌程序的开发。需要从以下方面进行考虑：

 

冷点位置

 

 

容器的冷点是灭菌过程最低F0值的位置。对于大容量注射剂，冷点位于产品几何中心和纵轴的底部（如图1所示），此冷点需要确认。在小容量注射剂中，冷点的定位并不典型，因为溶液升温的速率几乎与灭菌柜相同。冷点的位置也受容器方位的影响。当容器旋转时，可能找不到可辨识的冷点。

 

 

图1 液体容器中探头位置示例

 

装载方式

 

对于密封的液体装载，装载方式需要考虑以下方面：

 

蒸汽、蒸汽-空气混合物或过热水对装载容器的有效穿透，使整个装载具有一致的灭菌条件。

 

在灭菌后，确定装载有效冷却的范围，以保护产品的质量特性。如：培养基灭菌后的促菌生长的能力。

 

恰当的压力平衡，使容器的破损和变形降低至最小程度。

 

如果装载容器大小不同，应明确装载的最少数量和最多数量。

 

运行参数

 

表1列出了建立液体装载灭菌程序参数时需要考虑的因素：

 

表1 装载灭菌程序主要参数

 

 

第六节 湿热灭菌设备的确认