摘 要｜Abstract
国际标准化组织（ISO）于2022 年4 月19 日发布全球首个专门针对新型冠状病毒核酸检测的国际标准——ISO/TS 5798:2022《体外诊断检验系统——核酸扩增法检测新型冠状病毒（SARSCoV-2）的要求及建议》。本文对该标准通用要求部分进行分析及研究，并与我国2021 年11 月26 日发布的GB/T 40982—2021《新型冠状病毒核酸检测试剂盒质量评价要求》进行比对，以期为我国体外诊断试剂开发商、制造商，以及SARS-CoV-2 研究和诊断机构提供参考。
The first international standard specifically for nucleic acid testing of COVID-19—In vitro diagnostic test systems-Requirements and recommendations for detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) by nucleic acid amplification methods (ISO/TS 5798:2022) was published by International Organization for Standardization (ISO) on April 19,2022. This paper analyzes and researches on the general requirements of ISO/TS 5798:2022, and compares it with the Quality assessment requirements for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 nucleic acid detection kit (GB/T 40982—2021) released on November 26, 2021. This paper aims to provide reference for the in vitro diagnostic developers and manufacturers, as well as institutions and organizations supporting SARS-CoV-2 research and diagnostics in China.
新型冠状病毒（SARSCoV-2）是目前已知的第七种感染人类的冠状病毒[1]。冠状病毒是一种广泛分布于动物界的有包膜RNA 病毒，已在人类和其他哺乳动物以及鸟类中发现。冠状病毒之所以被如此命名，是因为在电子显微镜下观察时，可见病毒表面刺突蛋白所构成的形似光晕的棒状突起， 这些刺突蛋白能够促进病毒附着和进入细胞。冠状病毒大致呈球形，直径为118~136nm， 其基因组大小在26~32kb 之间， 是目前已知RNA 病毒中最大的病毒。由SARS-CoV-2 引起的疾病被世界卫生组织（WHO）命名为COVID-19[2]。
SARS-CoV-2 可通过飞沫和气溶胶传播，也有可能通过与无症状或有症状感染者接触等方式传播，并在上呼吸道和下呼吸道中复制。与严重急性呼吸综合征（SARS）和中东呼吸综合征（MERS）类似，已报告发生超级传播事件。大多数感染并不复杂，5%~10% 患者住院治疗主要是由于肺炎和其他严重炎症，呼吸系统和多器官衰竭等并发症的发生风险会随着年龄的增长，以及患有高血压、糖尿病、慢性心血管疾病、慢性肺部疾病以及免疫缺陷病而增加。
不可否认，现阶段COVID-19 仍然是国际关注的公共卫生事件，特别是可能出现SARS-CoV-2 新变异株和国际传播，继续对全世界人民带来健康威胁。目前虽然有些国家和地区已经取消对新冠防控的各种限制，但正如WHO 总干事谭德塞在2022 年9 月22 日媒体通报会上的讲话，大流行尚未结束，终点已经在望，但能够看到终点并不意味着已经到达终点，病毒仍在传播，仍在变化，出现更危险变异株的风险始终存在[3]。
疫情发生至今，各国均认识到，与研发疫苗和药物同等重要的，是需要具备快速识别、检测、隔离和治疗COVID-19 患者并对接触人群进行检疫以控制传播的能力。COVID-19 的临床管理及SARS-CoV-2 感染和传播的防控需要准确高效的体外诊断。现阶段已有不少检测SARSCoV-2 的方法和试剂盒，且更精准高效的检测手段还在持续增加。当前SARS-CoV-2 最主要的2种检测路径，分别是基于分子学的荧光PCR 方法的核酸检测和基于免疫学的SARS-CoV-2 抗原检测。抗原检测速度快、成本低，但有一定漏检率，结果需要确认测试；而核酸检测准确性高、特异性强，是目前SARS-CoV-2检测的金标准。
由此可见， 持续设计、开发和建立更加精准高效的SARS-CoV-2 核酸检测方法是COVID-19 防控的关键环节，也是为今后突发公共卫生安全事件应对储备标准与方法成果。在检测方法及试剂盒的开发和日常应用过程中，应建立其综合质量评价指标，确保检测结果的准确性。为此， 国际标准化组织（ISO）于2022 年4 月19 日正式发布全球首个专门针对SARS-CoV-2检测的国际标准——ISO/TS5798:2022《体外诊断检验系统—— 核酸扩增法检测新型冠状病毒（SARS-CoV-2） 的要求及建议》[In vitro diagnostic test systems-Requirements and recommendations for detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)by nucleic acid amplification methods][4]。本文主要对该标准通用要求部分进行分析及研究，同时与国家市场监督管理总局和国家标准化管理委员会于2021年11 月26 日联合发布的GB/T40982—2021《新型冠状病毒核酸检测试剂盒质量评价要求》[5]国家标准进行比对，以期为我国体外诊断试剂开发商、制造商，以及SARS-CoV-2 研究和诊断机构及组织提供参考。
1、 ISO/TS 5798:2022通用要求概述
ISO/TS 5798:2022 为采用核酸扩增技术检测SARSCoV-2 分析测试的程序步骤、设计开发、验证确认、生产转化和实施使用等提出要求和建议。该标准中详细规定了采用核酸扩增试验（NAAT） 进行SARSCoV-2 分子检测的流程。
1.1 检测前程序
检测前程序包括临床样本采集、运输、储存、样本溶解、核酸提取和浓缩。一般应考虑：使用适当的个人防护设备（PPE）；参考SARS-CoV-2 相关暴露或感染特点确定样本类型选择；根据所选样本类型，按照规范要求采集样本；样本在包装、运输和储存时，应采取适当的生物安全措施，并考虑对病毒核酸降解的影响；在实验室检测前，所有样本的初始处理（灭活前）应在经过验证的生物安全柜或封闭装置中进行。
1.2 检测程序
检测程序包括逆转录（cDNA合成）和适当的扩增方法。为避免交叉污染，所有检测活动均应使用单独的设备和（或）一次性用品，实验人员做好个人防护；样本提取、反应试剂制备和扩增处理应在单独的实验室进行，即使全自动化的分析检测也需要专用区域，避免在不同工作区移动仪器或共用设备；除非用于扩增后步骤，否则应尽量避免打开管盖；在进行检测时，应严格遵守核酸扩增法检测实验室的分区要求；可以将脱氧尿苷三磷酸（dUTP）和尿嘧啶-DNA 糖基化酶（UDG）加入反应混合液中，以消除扩增子污染；样本检测过程中应考虑废物的临时储存和处置问题，如果保存有价值的生物样本材料，可考虑建立生物库。另外，实验室应建立信息系统，用于采集、处理、记录、报告、存储或检索有关检测和检测前数据及相关信息。
1.2.1 计量学溯源
标准品应可溯源至已验证的SARS-CoV-2 标准物质， 如WHO 关于SARS-CoV-2 标准品[6] 或适当的等同物质，也可根据外部质量保证计划对试验进行验证。不同来源的标准物质检测结果应一致。标准物质应在规定的温度和条件下储存和处理，并在失效日期前使用，否则会影响检测结果。实验室可按照要求制备内部参考品，用于制备标准物质的材料应包括与检测样本相同类型或具有相同成分的物质，以及灭活的SARS-CoV-2 或假病毒；灭活病毒或制备的假病毒应在通过参考测量程序确定浓度后使用，例如采用经验证的定量方法，如数字PCR（dPCR）测定浓度以确保结果的准确性。应明确规定内部制备的标准物质的储存条件和时间，并对其进行验证，以避免目标核酸的损失。
1.2.2 阳性阈值
对于PCR 核酸扩增方法，阳性阈值是指Cq 临界值，可确定目标核酸是否存在，并定义哪些检测结果报告为“已检出”，哪些检测结果报告为“未检出”。设置合适的阳性阈值关系到检测的临床特异性和临床灵敏度。对扩增信号放大的确认可用于结果解释。Cq 值应与扩增曲线的形状相比较。在没有 SARS-CoV-2RNA 的情况下，经过设计和优化的SARS-CoV-2 PCR 将不会产生Cq 信号。任何区分阴性和阳性结果的Cq 临界值都应通过临床样本进行验证。高Cq 值用于排除由于病毒量低或非特异性扩增引起的极低信号。应注意，除非结果具有一致性，否则不同实验室的Cq 值不应直接比较，应使用有证标准物质进行比较。
1.2.3 包装和使用说明
所使用的试剂盒包装应完好无损，标签清晰并注明产品名称、批号、内容物、有效期、贮存条件等情况。使用说明应详细列出应用的预期用途和处理程序，包括目标用户、应用领域、检测结果解释、处理程序和注意事项。
1.3 检测后程序
检测后程序包括废物管理和检测结果报告等。由于SARSCoV-2 具有致病性，因此任何情况下都应遵循生物风险管理程序，并在完成实验室检测后恰当执行以下程序：剩余临床样本的保存和处理；扩增后废弃样品的处理；实验室和设备的清洁和净化；扩增后产物的储存和处置。
实验室检测后应提供相应的检测报告，检测报告的内容应至少包含以下信息：必要的样本信息、检测样本种类、检测方法、样本采集时间、贮存和运送时间及条件、报告发布时间、检测结果的判断和解释信息、结果审核和授权发布人员信息。
1.4 质量评价体系
ISO/TS 5798:2022 明确了准确性、检出限、包容性、特异性、稳健性等病毒检测的性能验证评价指标，全面构建了SARSCoV-2 核酸检测质量评价体系。核酸扩增检测中的质量属性包括但不限于：适当提取程序性能评估、评估检测试剂是否满足最低检测标准、分析特异性的综合评估、试验的检出限以及试剂稳定性评价。质量属性评价技术流程如图1 所示，包括对整个过程和关键分析性能的评价。对于只使用一种核酸提取方法的核酸扩增试验，或者提取方法是工作流程的一个必要组成部分时，核酸提取部分的质量评价并非是必需的。
1.5 扩增技术的选择
ISO/TS 5798:2022 指出应根据检测要求和环境，结合每种扩增技术的特点选择适合的核酸扩增技术。在适用条件下，逆转录后，每种扩增技术特点如下。
1.5.1 实时定量PCR（qPCR）
适用于样本定性或定量检测。建议使用荧光定量PCR 仪器，并提供稳定的电流供应。qPCR具有高分析灵敏度和高通量，操作简单，但反应时间相对较长。
1.5.2 dPCR
适用于样本绝对定量检测，由于样本需求量低，故其也适用于珍贵或降解严重的核酸样本。通常建议专门提供一台分析和读取样本的dPCR 仪，具有反应芯片或液滴发生器并提供稳定电流。尽管检出限低，但其检测通量取决于仪器系统，另外操作更加复杂，反应时间也相对较长。
1.5.3 等温扩增法
适用于样本定性评价，热循环器和稳定电流供应并不是必需的，该方法的特点是低检出限、低通量、反应时间短，易于操作。
2、 与国家标准比对
在ISO/TS 5798:2022 发布前，国家市场监督管理总局和国家标准化管理委员会在2021 年11 月26 日就联合发布了GB/T40982—2021《新型冠状病毒核酸检测试剂盒质量评价要求》，并于2022 年3 月1 日起实施。两个标准的比较结果详见表1。
ISO/TS 5798:2022 是由我国牵头，联合多国专家共同制定的，我国专家团队全程深度参与，发挥了关键作用，因此ISO/TS5798:2022 与 GB/T 40982—2021 本质和原则是一致的，都为病毒检测提供了质量评价要求和标准化手段。区别在于，ISO/TS 5798:2022 是在全球各国SARS-CoV-2 检测试剂和实验分析流程缺乏统一的技术规范和质量要求的大背景下提出，旨在国际范围内建立统一的SARSCoV-2 核酸检测标准，规范各国检测方法和流程，以保障检测质量，从而有效控制疫情蔓延，考虑到许多发展中国家体外诊断试剂还处于起步发展阶段， 因此ISO/TS 5798:2022 内容更加全面，规定更加细致，从术语定义到具体的检测程序、设计开发、验证确认、生产转化和实施使用都做了详尽说明。而GB/T40982—2021 主要从质量评价和实验方法方面提出要求，规范清晰明了，同时在附录部分详细注明SARS-CoV-2 核酸检测试剂国家参考品的具体用途、规格和组成、特性量值和注意事项，为国内体外诊断试剂开发人员和制造商及研究机构、医学实验室提供产品质量要求的基本遵循和可参考的技术依据，实操性更强。
3、 结语
疫情发生以来，我国一直着力提升核酸检测这项核心能力，3年来，我国核酸检测技术取得飞速进步，核酸检测能力全球领先。截至2022 年12 月， 国家药监局已批准128 个SARS-CoV-2检测试剂盒（45 个核酸检测试剂、41 个抗体检测试剂、42 个抗原检测试剂） 上市[7]。随着我国SARS-CoV-2 检测技术不断取得突破，产品质量不断提升，已成为全球最大的SARS-CoV-2检测试剂盒生产国，面向全球销售，国内多家体外诊断产品生产企业的SARS-CoV-2 核酸检测试剂被列入WHO 应急使用清单，以可靠优质的产品助力全球抗疫。此次ISO/TS 5798:2022 由我国牵头制定，从立项到发布仅用16个月，是国际标准化组织医用临床检验实验室和体外诊断系统标准化技术委员会（ISO/TC212）成立以来用时最短的非快速程序制定发布的标准，并最终以96%的赞成率高票通过，充分体现了我国体外诊断领域的技术创新水平。此外，参与国际标准制定还提升了我国在该领域的话语权和影响力，更加有利于国内体外诊断行业和企业的发展。
鉴于COVID-19 大流行的现状和不可预测的动态，仍需抑制SARS-CoV-2 传播。在检测方法和试剂盒的开发及日常应用过程中，应严格遵循国际标准和国家标准各项质量评价指标，确保检测结果的准确性。遵循国际标准，与全球SARS-CoV-2 核酸检测质量评价标准相一致，可促成SARS-CoV-2 核酸检测技术的兼容性和互通性，有助于我国核酸检测试剂的出口。
