前言
项目研发过程中，原辅料采用光散射法进行粒度分析时，为粒度分析方法的开发与验证提供技术支持。本文针对原辅料的光散射法粒度分析方法开发与验证全过程进行探讨，粒度分析方法开发和验证，均应基于代表性的样品进行。
一、分析方法开发
采用激光散射法进行粒度分析时，根据样品的性状和溶解性能，选择湿法或干法测定；湿法测定用于测定混悬供试品或不溶于分散介质的供试品，干法测定常用于测定水溶性或无合适分散介质的固态供试品。
1、湿法测定开发
湿法测试结果稳定，一次取样循环测量，特别适合非常细小的颗粒（几微米以下）；测量条件温和，尤其适合易碎的颗粒样品。
湿法测定开发过程中，需要考察的项目主要有样品的制备（分散介质、超声时间）、遮光度、搅拌速度等。
（1）样品制备
湿法测定时，样品分散很关键，需要有合适的分散剂，大多数情况下还需要选择表面活性剂或助分散剂、超声帮助样品分散均匀。
① 分散介质：湿法测定需要选择合适的分散介质。
a、不与样品发生反应（不溶解，也不会促进样品团聚）
b、很好地浸润样品
c、能够溶解所添加的添加剂/助分散剂
d、首选分散介质为水
e、当样品不易溶于水时，可考虑其他溶剂
f、如果样品微溶于水，可考虑配制饱和溶液进行测量
示例：水、饱和水溶液、Isopar G、葵花籽油等
② 表面活性剂或助分散剂
当样品在分散介质中，不能均匀分散时，呈漂浮、团聚等状态时，需要选择合适浓度的表面活性剂或助分散剂。常用的有：Tween、SDS、卵磷脂等。
示例：5%鸡蛋卵磷脂-Isopar G溶液、2%吐温-80溶液或2%吐温-20溶液
③ 超声
超声是非常有效的分散手段，合理控制超声强度与时间，可以有助于样品分散。增加超声强度比延长超声时间更有效。可以通过超声滴定，比较无超声，或不同超声时间，结合样品的粒度变化及RSD的范围，选择合适的超声方式。超声过程中，要注意所用超声仪器的超声强度，即超声波频率、超声波功率。不同的超声强度，对样品团聚颗粒的分散程度不同，可能会影响数据的重现性。应在方法中注明样品超声处理的仪器或者超声强度，提高方法在不同实验室操作时的重现性。
示例：采用超声处理样品，结果如下图，随着超声时间的延长，最终粒径的变化趋于平缓且RSD满足标准，表明测得结果可接受。
超声时间
（2）遮光度
加入足够的有代表性的样品，直到有稳定的遮光度和数据信号。样品量太少，则信噪比会比较差，或者样品的代表性不够，特别是对于宽分布的样品。样品量太多，则会发生多重衍射，影响最后的测量结果，特别是粒径比较小的时候（典型的＜10μm）。可以通过遮光度滴定，结合样品的粒度变化及RSD的范围，选择合适的遮光度。对于大部分样品，遮光度建议考察值为：
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样品的Dx50
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遮光度建议范围
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＜10μm
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5%~10%
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10μm＜Dx50＜100μm
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10%~15%
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＞100μm
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15%~20%
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（3）搅拌速度
搅拌，采用机械剪切力分散样品，避免颗粒沉淀，保持良好的悬浮；过高的转速可能会破碎颗粒，或产生气泡。对于样品池中搅拌速度的考察，特别是对于比重大的颗粒，应进行泵速滴定（一般为1500~2500rpm）。需要结合粒度的变化及RSD的范围，筛选一个合适的搅拌速度将大颗粒悬浮起来，保证整个样品池流动的样品均匀。
示例：对某样品进行泵速滴定，＞2500rpm处于平台期，因此可选择2500rpm作为该品种的搅拌速度。
2、干法测定开发
干法测定，所有物料必须悬浮在气流中，只有通过光束的物料才能被测量。测量时，只有物理力作用，如颗粒之间的碰撞，颗粒与样品池、输送管道碰撞，高压空气等。干法分散是样品分散和破碎之间的竞争。
干法测定开发过程中，需要考察的项目主要有遮光度、分散气压、进样速度、料斗间隙等。
（1）遮光度
遮光度大小，反应的是进样量的多少。进样量太少，遮光度过低，取样代表性不足；进样量太高，遮光度过高，多重衍射导致结果偏小。干法分散，通常遮光度稳定在0.5~6%。
（2）进样速度和料斗间隙
样品的进样状态，受进样速度和料斗间隙影响，主要取决于颗粒粉末本身的流动性。一般设置料斗间隙为1.0mm，或根据样品流动状态调节。进样速度通常手动从低到高调节，直到获得一个平滑稳定的流动，保证遮光度在测量范围内，同时满足测量过程样品的需求量，保证清洁系统时无大量残留样品。
（3）分散气压
选择最佳的分散气压，保证颗粒既能避免发生团聚，又避免颗粒被高压破碎。通过压力滴定，改变分散气压做一系列重复实验，可以判定合适的分散气压。
a、从高压做到低压，考察压力变化对粒径的影响
b、一般从4bar-3bar-2bar-1bar-0.5bar甚至于不加压力
c、如有必要，可先通过显微镜观察样品形态，确定初始压力范围
示例：如下图，分散气压过小，样品没有充分分散，测定数据偏大；分散气压过大，可能造成对样品的破坏（气流粉碎效应）。可选择1.5~2bar（平台期）作为分散气压，大于2bar出现气流粉碎效应。
3、其他事项
湿法测定和干法测定开发过程中，均需要注意激光粒度分布仪类型、颗粒类型、光学参数（颗粒折射率/吸收率）、测量时间、分析模型、结果类型、粒度分级等。这些项目可能不需要考察，但应注明相关信息。在进行方法转移时，这些项目可能会影响粒度测定的结果。
二、 分析方法验证
方法验证是指通过实验室研究确定该程序满足预期分析应用的过程。由于粒度测定方法的独特特征，粒度测定方法的验证与ICH指南Q2A和Q2B和USP通则<1225>中描述的其他分析方法的验证不同。一般来说，粒度测定方法的验证通常涉及精度（重复性和中间精度）和耐用性的评估。其他ICH定义的验证参数，如特异性、线性度、范围、准确度、检出限和定量限，通常不需用于颗粒测定方法的验证。粒度分析方法验证，建议验证重复性、中间精密度和方法耐用性。
1、重复性
对样品进行重复性验证。由一名分析人员平行制备6份样品测定，在同一天内测试。计算D10、D50、D90的相对标准偏差（RSD）。
2、中间精密度
两名分析人员，在不同时间，分别对同一份样品，各平行制备6份样品测定，在同一台或不同仪器设备上测试。分别计算6次测定结果的D10、D50、D90的相对标准偏差（RSD），并计算测定结果总共12个测试结果的相对标准偏差（RSD）。
如样品与“重复性”项下为同一样品，其中一人的数据可以采用“重复性”项下的测定结果。
3、耐用性
耐用性是指在测试条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，即方法参数故意进行微小变化后，方法仍能保持不受影响的能力，并提供在正常范围内使用的可靠性说明。耐用性的评估在方法开发阶段就应该被考虑。
对光散射法，建议对以下几项方法参数进行耐用性验证：
（1）进样浓度，即样品量
（2）分散气压（干法测试）
（3）超声和搅拌速度（湿法测试）
当故意小幅改变方法参数时，测试结果应显示可靠性。
三、 标准
《中国药典》2020版四部通则“0982粒度和粒度分布测定法”收录了第三法（光散射法），仅对仪器的一般要求和测定法进行了简单介绍。USP<429>和EP 2.9.31基于ISO 13320-1(1999)和9276-1(1998)开发的，国内有相应的中文版GB/T 19077.1粒度分析-激光衍射法和GB/T 15445.1粒度分析结果的表述。仪器校准和确认的主要差别为：
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标准
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USP<429>
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EP 2.9.31
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ChP 2020
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GB/T 19077.1
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ISO 13320-2009
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重复性（系统确认）
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标准粒子
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合适的标准物质
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合适的标准物质
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粒子最大粒径与最小粒径比约10:1
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颗粒大小直径之比10:1
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x90/x10=1.5-10
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测量次数
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/
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6
|
5
|
5
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≥3
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D（50）
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RSD ≤10%
|
RSD ≤10%
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偏差及RSD ≤3%
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RSD ≤3%
|
RSD ≤3%
|
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D（10）
D（90）
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RSD ≤15%
|
RSD ≤15%
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偏差及RSD≤5%
|
RSD ≤5%
|
RSD ≤5%
|
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粒径小于10μm
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RSD翻倍
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RSD翻倍
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偏差及RSD翻倍
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RSD翻倍
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RSD翻倍
|
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准确度（校准）
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标准粒子
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认证标准物质
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认证标准物质
|
/
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标准物质或有证书的物质
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x90/x10=1.5
|
|
测量次数
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≥3
|
≥3
|
/
|
≥3
|
≥3
|
|
D（50）
|
RSD ≤3%
|
RSD ≤3%
|
/
|
平均值和标准值之差≤3%
|
D(10)~D(30)
RSD≤3%
|
|
D（10）
D（90）
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RSD ≤5%
|
RSD ≤5%
|
/
|
平均值和标准值之差≤5%
|
D(30)~D(70)
RSD≤2.5%
|
|
RSD翻倍
|
RSD翻倍
|
RSD翻倍
|
/
|
翻倍
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D(70)~D(90)
RSD≤4%
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目前NMPA尚未应用第三法进行API粒度分析方法开发和验证的相关指导原则。粒度的评价指标一般为D10、D50、D90。建议方法开发与验证时可参照USP<429>和EP 2.9.31的要求，RSD(D10)≤15%，RSD(D50)≤10%，RSD(D90)≤15%；当粒径小于10μm时，RSD值可以翻倍。当然，也可根据物料自身情况，合理制定标准。
参考文献：
EP 2.9.31 Particle size analysis by laser light diffraction
USP429 LIGHT DIFFRACTION MEASUREMENT OF PARTICLE SIZE
GB/T 19077.1-2008/ISO 13320-1：1999.粒度分析 激光衍射法 第1部分：通则
GB/T 15445.1-2008《粒度分析结果的表述 第1部分:图形表征》
ISO 13320-2009. Particle size analysis — Laser diffraction methods
Zhigang Sun, Ph.D. Particle Size Specifications for Solid Oral Dosage Forms：A Regulatory Perspective. American Pharmaceutical Review
