他达拉非（Tadalafil）是一种选择性、可逆性的磷酸二酯酶 5（PDE5）抑制剂，用于治疗男性勃起功能障碍（ED），该药具有诸多优点如选择性高、不良反应小、半衰期较长等[1~2]。他达拉非片原研品为美国礼来公司生产的 Cialis。他达拉非的生物药剂学分类（BCS）为Ⅱ类[3~4]，即低溶解性-高渗透性药物，原料粒径对产品溶出和体内生物等效具有关键影响。目前国内有针对他达拉非片的制备和体内外评价进行研究[5~6]，上述主要研究了处方组成、溶出曲线和 Beagle 犬体内药动学特征，抑或仅对人体生物等效性试验开展研究[7~8]，未见对处方工艺、溶出曲线和人体生物等效性的综合研究。因此本研究以 Cialis（规格：20 mg）为参比制剂，对自制品处方工艺进行筛选，并考察二者溶出曲线相似性，最终通过人体内生物等效性研究确定自制品的处方工艺。
1、仪器与材料
1.1 仪器
GF-300A2X 型高效万能粉碎机（上海天祥·健台）；J-50 型气流粉碎机（意大利马西姆公司）；LHS300 型湿法混合制粒机（浙江迦南科技）；ZL450 型门式整粒机（浙江迦南科技）；FZG-5 低温真空烘箱（南京飞龙制药）；HZD-1000 型自动提升料斗混合机（浙江迦南科技）；S250-SMART型 32 冲压片机（山东新马制药）；BG-150E 型高效智能包衣机（浙江江南制药）；DPR-320G 热带型泡罩包装机（瑞安市江华机械）；YD-Ⅱ型片剂硬度测试仪（天津光学仪器）；Mastersizer-3000型马尔文粒度仪（英国 Malvern 公司）；RC12A 型溶出度仪（天津天大天发）；LC-20A 型、LC30AD型高效液相色谱仪（日本 Shimadzu 公司）；Quad 6500 型三重四极杆质谱仪（加拿大 Sciex 公司）。
1.2 材料
他达拉非片（Lilly USA，商品名 Cialis，规格 20 mg，批号 C949202），他达拉非（珠海联邦制药），一水乳糖 200M（DMV-Fonterra）；微晶纤维素（山东聊城阿华）；交联羧甲纤维素钠（德国瑞登梅尔）；十二烷基硫酸钠（葛店人福）；羟丙纤维素-L（日本曹达，取代度 65%）；硬脂酸镁（山东聊城）；薄膜包衣预混剂（上海卡乐康）；异丙醇、乙腈、正己烷均为色谱纯；其他试剂均为分析纯。
2、方法与结果
2.1他达拉非片的制备
参考俄罗斯药监局公布的礼来公司产品 Cialis（规格：20 mg）药品说明书[9]，选择与 Cialis 相同的辅料种类和用量进行样品制备。称取粉碎后原料 70.00 g、交联羧甲纤维素钠 44.10 g、十二烷基硫酸钠 3.43 g 和一水乳糖 858.18 g，混合均匀，另取羟丙纤维素 28.18 g 溶于纯化水中配制成黏合剂溶液，加入至上述完成预混的物料中，湿法制粒，干燥，整粒，再将微晶纤维素 183.75 g、交联羧甲纤维素钠 34.30 kg 和硬脂酸镁 3.08 g 加入干颗粒中，混合 10 min，压片，包衣，即得自制品。
2.2溶出曲线方法
2.2.1溶出条件
参考他达拉非片进口药品注册标准[10]，溶出方法选择桨法；转速 50 r·min-1；溶出介质为 0.5%十二烷基硫酸钠溶液，体积 1 000 mL，温度 37.0 ℃。
2.2.2色谱条件
色谱柱填充剂为辛烷基硅烷键合硅胶（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流动相为 0.1%三氟乙酸溶液:乙腈=55:45（V/V）；检测波长为 285 nm；流速为 1.2 mL·min-1；柱温 40 ℃；进样体积 50 μL。
2.2.3 对照品溶液
精密称定他达拉非对照品约 20 mg，置 100 mL 量瓶中，用乙腈 20 mL 超声溶解，用溶出介质稀释成 0.20 g·L-1 的贮备液，摇匀，精密量取 5 mL 置 50 mL 量瓶中，用溶出介质稀释成 20 mg·L-1 的对照品溶液，摇匀。
2.2.4 供试品溶液
取他达拉非片 6 片，按溶出条件进行操作，在各取样点时间分别取溶液 10 mL，滤过，取续滤液作为供试品溶液，并及时补充溶出介质 10 mL。
2.2.5 方法学验证
本色谱条件下他达拉非进样量（X）在 0.105～2.090 μg 范围内与峰面积（Y）线性关系良好，回归方程为 Y=1.689×106X+798，r=1.000 0。取 10、30 min 溶出液配制供试品溶液，分别测定室温放置 0、1、2、3、4、6、8、10、12 h 后样品的峰面积，测定结果 RSD 值分别为 0.10%、0.10%，表明该方法稳定性良好。选择四个浓度（100%、80%、40%、20%）考察回收率（n=3），均值为 100.3%，RSD 值为 0.50%，表明该方法准确度和精密度良好。
2.3 处方工艺考察
他达拉非片为普通薄膜包衣片剂，其活性成分他达拉非的生物药剂学分类（BCS）为Ⅱ类（低溶解性、高渗透性）[3~4]，结合欧盟 EMEA 关于他达拉非片科学性论述内容[11]，在制备片剂前需对原料进行微粉化处理，再采用湿法制粒工艺进行样品制备。试验初期选择高效万能粉碎（100 目筛）对原料进行前处理。为保证自制品与参比制剂的质量一致性，自制品的辅料种类和用量主要参考俄罗斯公布的 Cialis 药品说明书（20 mg），选择一水乳糖（70.05%）和微晶纤维素（15.0%）为填充剂、交联羧甲纤维素钠（6.4%）为崩解剂、羟丙纤维素（2.3%）为黏合剂、十二烷基硫酸钠（0.28%）为助流剂和硬脂酸镁（0.25%）为润滑剂。本研究在此基础上，以溶出曲线相似性为评价指标，对处方工艺中的黏合剂浓度、片芯硬度、湿法制粒时间和原料前处理方式分别进行考察。
2.3.1黏合剂浓度考察
取羟丙纤维素3 份（每份 28.18 g），分别溶于 3 份纯化水（441.49 g、324.07g、253.62 g），配制 6%、8%和 10% 3 个浓度的溶液，参照“2.1”项下方法，将上述 3 份溶液全部用于制备片剂，再按照“2.2”项下方法进行溶出曲线考察，结果见图 1。
在湿法制粒过程中发现，黏合剂浓度为 6%时，水量最多，所制颗粒有部分呈条状；浓度 10%时，水量最少，所制颗粒较少、细粉较多；浓度 8%时，水量居中，制得颗粒外观较为理想，颗粒较多，物料流动性和可压性均良好。3 个浓度（6%、8%、10%）所制片剂与 Cialis 的溶出曲线相似因子 f2 值分别是 61、76、74，均符合溶出相似的要求。综合考虑，选择黏合剂浓度为 8%。
2.3.2片芯硬度考察
片芯的硬度对片芯的脆碎度、包衣的磨损情况、产品的崩解和溶出行为具有直接影响，为了确定硬度对本品的影响，筛选合理的硬度范围，故对硬度进行了考察，分别按照4～6 kg、6～9 kg 和 9～11 kg 3 个硬度范围进行样品制备，对不同硬度对应的压片情况、脆碎度、包衣情况和溶出曲线进行考察，结果见图 2。
由考察结果可知，硬度 4～6 kg 时，片芯脆碎度相对较高，包衣情况磨损较大，不符合制备要求；硬度 6～9 kg 和 9～11 kg 均符合制备要求，且两硬度范围自制品与 Cialis 的溶出曲线相似因子f2 值分别是 80 和 64，选择与 Cialis 溶出相似度更高的 6～9 kg 作为自制品的硬度控制范围。
2.3.3 湿法制粒时间考察
湿法制粒的搅拌制粒时间主要影响所制颗粒的松紧程度，最终影响产品的溶出行为。针对湿法制粒操作，设置湿法混合制粒机参数（搅拌桨Ⅰ速与制粒桨Ⅰ速），分别考察制粒 2、3、4 min 样品的溶出曲线，结果见图 3。
如图 3 所示，随着湿法制粒时间的延长，产品的溶出速率有逐渐降低的趋势。当制粒时间为 2 min时，所制样品与 Cialis 的相似因子 f2值为 59，当制粒时间为 3～4 min 时，所制样品与 Cialis 的溶出行为则具有更好的相似性（f2=80、75），因此选择 3～4 min 作为自制品的湿法制粒时间。
2.3.4 原料前处理考察
由于他达拉非的生物药剂学分类为Ⅱ类，不仅需要对原料进行微粉化处理，而且需要在溶出介质中添加增溶剂 SDS。为了确认原料粒度的影响，分别采用高效万能粉碎和气流粉碎的方式对原料进行处理。完成样品制备后，为提高溶出曲线区分力，将溶出介质中的增溶剂 SDS 浓度由 0.5%降低至 0.3%进行溶出曲线对比。两种粉碎方式的原料粒度分布结果见表 1，溶出结果见图 4。
由考察结果可知，气流粉碎原料比高效万能粉碎原料粒径更细，且在 0.3%SDS 溶出介质中，采用高效万能粉碎原料制备的自制品与 Cialis 的相似因子 f2值为 63，而采用气流粉碎原料制备的自制品与 Cialis 的相似性更高（f2=76），因此选择气流粉碎作为原料的前处理方式。
2.4 处方工艺确认
根据处方工艺考察结果，选择气流粉碎原料进行中试样品制备（批量：10 万片）：称取气流粉碎后原料 2.011 kg（含他达拉非 2.000 kg）、交联羧甲纤维素钠 1.26 kg、十二烷基硫酸钠 0.098 kg和一水乳糖 24.52 kg，混合均匀，另取羟丙纤维素 0.805 kg 溶于 9.26 kg 纯化水中（浓度 8%），加入至上述完成预混的物料中，湿法制粒 3～4 min，干燥至水分≤4.0%后，整粒，再将微晶纤维素 5.25kg、交联羧甲纤维素钠 0.98 kg 和硬脂酸镁 0.088 kg 加入干颗粒中，混合 10 min，压片（片芯硬度控制 6～9 kg），包衣（理论增重 4%），即得自制品。
分别测定自制品和参比制剂在 0.5%SDS 溶液（A）、0.3%SDS 溶液（B）、含 0.5% SDS 的 0.01mol·L-1 的盐酸溶液（C）、含 0.3% SDS 的 pH 4.5 醋酸钠缓冲液（D）、含 0.3% SDS 的 pH 6.8 磷酸盐缓冲液（E）5 种溶出介质中的溶出曲线，见图 5。
由考察结果可知，自制品与 Cialis 在上述 A～E 5 个溶出介质中的相似因子 f2 值分别为 58、75、65、70、62，均符合相似要求。
2.5生物等效性研究
为进一步确认自制品与 Cialis 体内药效一致性，选择采用“2.4”项下处方工艺确认批自制品与Cialis 进行空腹条件下给药的人体生物等效性研究。
2.5.1 受试者选择
本研究经东莞康华医院伦理委员会批准。所有受试者均签署了知情同意书。本研究入组10名健康成人男性受试者，年龄为18~45岁，身体质量指数（BMI）在19 kg·m-2至26 kg·m-2之间。
2.5.2 给药方法
采用单剂量、两序列、两周期、自身交叉的试验方案，受试者统一禁食过夜，次日清晨空腹口服 1 片自制品或 Cialis，服药后禁食 4 h，4、10 h 以后统一进餐。
2.5.3 血样采集和处理
分别于给药 0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、4.00、5.00、6.00、9.00、12.00、24.00、48.00、72.00、96.00 h 采集静脉血（每管 4 mL）至已标记好含有 K2EDTA的真空采血管中，轻柔颠倒 6 次混匀，离心 10 min，抽取上层血浆置于 2 个 2 mL 冻存管中，1 h 内转移至-20℃或以下冰箱中暂存，24 h 内转移至-80℃冰箱中储存。
2.5.4 测定方法和样品处理
2.5.4.1 色谱条件
色谱柱 XBridge C18（3.5 μm，4.6mm×50 mm），流动相 A 为含 5 mmol·L-1 甲酸铵和 0.1%甲酸的水溶液，流动相 B 为乙腈：水（90:10，V/V）的混合溶液，梯度洗脱（0.01 min 50%B，1.70 min 50% B，1.80 min 100% B，2.60 min 100% B，2.70 min 50% B）。流速：300 μL·min-1；柱温：30 ℃；进样体积：20 μL。
2.5.4.2 质谱条件
电喷雾离子源（ESI）；正离子多反应监测模式（MRM）；用于定量分析的离子对为他达拉非 m/z 390.2→268.1，他达拉非-d3（内标）m/z 393.2→271.0，碰撞能量（CE）17 eV；去簇电压（DP）130 V。源参数：喷射电压（IS）3 000 V，离子化温度（Temp）500 ℃，碰撞气（CAD）5 psi，气帘气（CUR）30 psi，喷雾气（Gas1）60 psi，辅助气（Gas2）60 psi。
2.5.4.3 血浆样品处理
在 96 孔板中加入血浆样品 100 μL，内标溶液（他达拉非-d3）50 μL，乙腈300 μL，涡流混匀 10min，离心 10 min（8℃，4 000 r·min-1）。取上清液 200 μL 至另一洁净 96 孔板中，用 300 μL 流动相 B 复溶，取上清液 20 μL 进行 LC-MS/MS 分析。
2.5.5 检测结果
采用 LC-MS/MS 法测定不同时间点血浆中他达拉非的药物浓度，平均血药浓度-时间曲线见图 6。采用 Phoenix WinNonlin 7.0 软件以非房室模型法（NCA）对血药浓度数据进行拟合处理，自制品和 Cialis 的平均药动学参数描述性统计结果见表 2。
由上述结果可知，自制品与 Cialis 的达峰时间（Tmax）、达峰浓度（Cmax），AUC0-t 和 AUC0-∞均相近。采用 SAS 9.4 软件进行统计分析，采用平均生物等效性评价的方法对自制品和 Cialis 的药代动力学参数进行评价，自制品与 Cialis 的 Cmax、AUC0-t 和 AUC0-∞的 90%置信区间分别为 84.35%～98.00%、86.32%～106.43%和 85.91%～106.89%，均落在可接受范围内（80%~125%），可知自制品与 Cialis 具有生物等效性。
3、讨论
本研究以 Cialis 处方为基础、以体外溶出行为作为评价指标对自制品进行处方工艺筛选。当溶出介质中增溶剂 SDS 浓度为 0.5%时，增溶效果可能会掩盖不同粒径原料所制备的样品的溶出差异。根据 SDS 临界胶束浓度（8.2 mmol·L-1，换算成质量体积分数为 0.236%）[12]，在保证增溶效果的前提下，将 SDS 浓度降低至 0.3%，可提高溶出曲线的区分力，有助于筛选出更合理的原料前处理方式。
按照确定的处方工艺进行中试样品制备，所制样品与 Cialis 的体外溶出行为相似，且人体生物等效性研究显示自制品与 Cialis 的 Cmax、AUC0-t 和 AUC0-∞的 90%置信区间均落在可接受范围内（80%~125%），证明自制品与 Cialis 在体内可达到生物等效。
他达拉非片生物等效性研究的样本量需根据试验结果的几何均数比（GMR）和个体内变异系数（CV）等计算。本试验中 CV 最大值为 13.19%，可知他达拉非属于非高变异药物，结合查表法可知，检验效能为 80%时估算样本量为 12 例（未考虑脱落 20%的情况），因此在以后他达拉非片生物等效性研究中，可适当将样本量增加至 12 例以上。
本研究过程中所采用的原料前处理方式、处方工艺、经过调整的溶出方法和生物等效性研究方法，可为他达拉非片的样品研制、体外溶出和体内生物等效性研究提供相应指导。
