通过试验设计（DOE）能够科学高效地确定关键物料属性（CMA）、关键工艺参数（CPP）对产品关键质量属性（CQAs）的影响，有效解决产品的流程改进与质量控制问题，DOE已日益成为医药研发过程中的关键工具。
本文按照DOE基本流程，结合关于生物工程肝素制备的文献[1]，解析医药研发DOE各阶段实际操作过程中需要重点关注与考虑的一些问题。
1、计划阶段
在DOE的计划阶段首先应该明确试验拟解决的问题与目标，进而分析产品的CQAs以确定试验研究的响应指标，并基于风险分析确定可能显著影响CQAs的潜在变量因子。同时关注试验过程和测量系统的受控状态，最终制定科学合理的试验计划。
文献中作者认为，保证生物工程肝素有效性的关键在于保证肝素产品的CQAs（分子量、N-乙酰化程度）处在目标范围内，并且从商业化生产的角度来讲，收率同样关键，因此，确定了DOE的3个响应指标：分子量、N-乙酰化程度、收率。与上述3个响应指标密切相关的工艺步骤是肝素原去乙酰化处理环节，如图1[1]所示：
图1 肝素原去乙酰化示意图[1]
基于原理分析得出，肝素原起始浓度、NaOH浓度、反应时间、温度是最有可能影响上述3个响应指标的因子，因此，计划首先通过2水平全因子试验设计，筛选出对响应指标具有显著影响的关键因子，之后通过Box-Behnken响应曲面设计，获得关键因子与响应指标的多元二次拟合方程，最后对拟合方程的有效性进行验证。
同时，试验过程（例如反应温度、时间）与响应指标测量（例如分子量的测定）皆严格受控，能够保证试验体系的有效性。制定完善的试验计划之后，进入关键因子的筛选阶段。
2、筛选阶段
在DOE的筛选阶段，可根据历史试验数据、过程原理、风险分析与经验来确定潜在因子，并对潜在的因子进行筛选，确定对响应指标具有显著影响的关键因子，用于下一阶段的优化或预测。文献中对4个潜在因子进行2水平全因子试验，得出了多元一次拟合方程，如图2[1]：
图2 肝素原去乙酰化试验因子与响应值的多元一次拟合方程[1]
根据拟合方程系数的显著水平，确定NaOH浓度、反应时间、温度对分子量、N-乙酰化程具有显著影响，并将在下一阶段使用这3个关键因子进行优化或预测。
3、优化或预测阶段
在DOE的优化或预测阶段，通常通过中心复合设计（CCD）、Box-Behnken响应曲面设计[2]，建立起关键因子与响应指标的多元二次拟合方程函数关系，可据此确定关键因子的最优水平组合或者根据期望的响应指标值预测出所需的关键因子水平。
值得注意的是，文献中肝素原起始浓度对3个响应指标的影响均不显著，并且4种潜在因子对收率指标的影响同样均不显著。那么在接下来的优化或预测阶段应该如何处置？此外，在优化或预测阶段关键因子的设定水平是否需要进一步调整？这往往是DOE实际应用中面临的关键问题。
首先，对于非关键因子设定水平，应重点权衡是否对医药产品生产具有积极作用，例如经济性、高效性等。文献中将肝素原起始浓度设定在研究范围的最高水平，原因是高浓度有利于提高肝素原的批处理通量，能够提高生产的经济性与效率。
其次，4种潜在因子对收率指标的影响均不显著，这意味着在所考察的因子水平范围内，收率的变异主要是由误差引起，而非随因子设定值改变发生显著性变化，因此，在优化或预测阶段，若因子设定值范围未发生改变，那么不再将收率作为优化或预测的过程指标。
第三，优化或预测阶段对关键因子设定水平进行一定的调整往往是必要的。需要根据具体的过程目标，将接近最优响应值的因子水平设定为中心点，这样有利于保证拟合函数对最优值预测能力[2]。此外，历史试验数据可作为因子水平范围选择的重要参考依据。
根据上述原则，文献中作者通过Box-Behnken曲面响应建立了关键因子与响应指标的多元二次拟合方程函数关系(图3[1])，并绘制了曲面响应图（图4[1]）。并在下一阶段对曲面相应函数关系进行了有效性验证。
图3 肝素原去乙酰化试验因子与响应值的多元二次拟合方程[1]
图4 肝素原N-乙酰化程度对碱浓度、时间的响应曲面[1]
4、验证阶段
验证阶段需要在预测的最优条件下执行试验以确认实际结果与预测所得优化结果的相符性，以确定拟合函数用于优化或预测的有效性。
文献中作者使用不同分子量的起始肝素原进行验证，根据肝素原分子量与产品目标分子量，计算出所需的 Depolymerization factor目标响应值，通过函数预测出达到期望目标响应值所需的试验条件（关键因子水平），按照上述试验条件执行试验，验证实际所得肝素产品分子量与目标产品分子量的接近程度。
此阶段应重点考虑拟合函数的预测能力，而预测能力主要会到受试验误差的影响，例如试验条件的偶然性波动、响应指标测量误差，导致拟合函数建立所依据的试验信息可靠性变差[3]，从而降低了拟合函数的真实预测能力。由此可见，试验过程中关键参数、响应指标测量系统的受控状态对整个DOE的质量至关重要，需要着重关注。在预测有效性得到保证的基础上，可进一步建立起过程目标允许的范围与关键因子水平所允许范围之间的对应关系，为进一步建立设计空间（DSp）提供支持。
本文结合DOE基本流程架构与案例文献，条理性解析了医药研发DOE各阶段实际操作过程中需要重点考虑与关注的关键问题，这将为DOE在医药研发领域的实际应用提供重要的实用性参考。
