我们在准备反相液相色谱的流动相时，甲醇和乙腈被广泛用作有机溶剂。但是为什么有时候使用甲醇，而有时候使用乙腈呢？这两种有机溶剂之间有什么区别呢？
乙腈＆甲醇的性质
乙腈是一种极性的不可电离非质子酸，由于存在由于存在C≡N，它可以带来π-π相互作用，又因为氮原子具有高电负性，它也可以与另一分子形成氢键。
甲醇是一种极性的可电离质子酸，它可以和另一个分子相互作用形成氢键。为什么甲醇也可以形成氢键呢？
因为甲醇上有-OH的存在，氧是高电负性原子，它可以部分极化分子。它在氧上产生微负电荷，在氢原子上产生微正电荷。因此，这个微正电荷的氢原子可以与微负电荷的原子形成氢键。
那么什么是极性可电离质子溶剂？极性可电离质子溶剂指的是具有氢原子与氧（如羟基）、氮（如胺基）或氟（如氟化氢）结合的溶剂。乙腈中存在氢原子，但这些氢原子不与氧形成氢键，因此，不能说乙腈是可电离的极性溶剂。而甲醇，氢原子可以与氧形成氢键，因此，甲醇是可电离极性溶剂。
截止波长
当使用这些有机溶剂配制流动相，选择检测波长时，了解它们的紫外截止波长是非常重要的。乙腈与甲醇相比，它的截止波长更低，约为190nm，而甲醇约为210nm，这意味着使用乙腈时可以在190nm的低波长下进行检测，但使用甲醇作为有机溶剂，可能无法使用低于210nm的波长，因为此时会产生很多基线噪音。
经济成本
另一个重要因素是甲醇和乙腈的经济成本。乙腈价格高于甲醇，因此当有可能使用甲醇代替乙腈时，可以使用甲醇以节省实验室成本。
有机溶剂比与柱压的关系
我们的HPLC系统一般能承受的背压约为4000psi，超过这个数值泵就无法工作。因此，应优先选择产生最小背压的流动相。有机溶剂和背压之间存在怎样的关系呢？
在上图中，使用色谱柱：ODS（150mm×4.6mm，5μm），流 速：1.0ml/min，比较了乙腈与水和甲醇与水混合物在不同条件的压力。由于较高的温度导致溶剂的粘度降低，压力也趋向降低。将柱温设置在25~40℃之间进行比较，我们可以看到甲醇的压力更高。因此，将流动相中的乙腈替换为甲醇时，需要重新评估仪器系统和色谱柱的耐压能力。
乙腈＆甲醇的溶剂强度比较
现在我们来了解一下这两种重要有机溶剂的强度。图3展示了使用ODS柱分离对羟基苯甲酸类化合物（即对羟基苯甲酸酯）的一个例子。可以看出当乙腈和甲醇以相同的比例与水混合时，乙腈流动相的洗脱强度更大。
图4中的等效溶剂强度示意图有助于在这些溶剂之间进行转换时近似计算洗脱强度。例如，如果我们先前使用的是50/50（体积比）的乙腈/水作为流动相，在转换为甲醇时，等效的甲醇/水比例将为60/40（体积比）。
图3中分析的是以下6种分析物：甲基对羟基苯甲酸酯，乙基对羟基苯甲酸酯，异丙基对羟基苯甲酸酯、丙基对羟基苯甲酸酯、异丁基对羟基苯甲酸酯以及正丁基对羟基苯甲酸酯。这些对羟基苯甲酸酯在甲醇中的流动相中，它们都可以被有效地保留，但是当换成到乙腈时，保留时间会大大降低。这个实验证明了乙腈在反相液相色谱中的洗脱能力更强。
那么为什么甲基对羟基苯甲酸酯会先洗脱出来，而正丁基对羟基苯甲酸酯却最后才洗脱出来？
看一下甲基对羟基苯甲酸酯和丁基对羟基苯甲酸酯的结构，甲基对羟基苯甲酸酯的碳链长度较短，而正丁基对羟基苯甲酸酯的碳链长度较长。碳链长度的变化会影响化合物的非极性，碳链较短的化合物非极性较弱，因此在这种情况下，可以清楚地看到正丁基对羟基苯甲酸酯与甲基对羟基苯甲酸酯相比非极性更强。
我们使用的是Shim-Pack ODS色谱柱，C18色谱柱的保留是由疏水或非极性相互作用所决定的。非极性化合物会在C18固定相上相互作用或保留更长时间，在这种情况下，由于正丁基对羟基苯甲酸酯具有更高的非极性特性，它会在C18固定相上保留更长时间。
乙腈＆甲醇洗脱选择性的差异
图5 甲醇和乙腈的选择性差异
下一个重要的点是甲醇和乙腈之间的洗脱选择性不同，我将根据苯酚、苯甲酸和对甲苯酸的洗脱来解释这两种不同的选择性。
甲醇的流动相是缓冲液：甲醇（40:60），而乙腈的流动相是缓冲液：乙腈（60:40）。使用的色谱柱是Shim-pack VP-ODS，在这种情况下，我们会发现用甲醇时，苯酚首先洗脱，然后是苯甲酸，最后是对甲苯酸，但是在乙腈的条件下，会发现苯甲酸首先洗脱，然后是苯酚，最后是对甲苯酸。那么为什么用乙腈更容易洗脱苯甲酸呢？是什么使苯甲酸先于苯酚洗脱？
在这种情况下，我们需要了解苯甲酸与乙腈之间存在额外的相互作用，即与乙腈的碳氮三键和苯甲酸上的羰基氧上的π电子的π-π相互作用。因为甲醇不含π电子，因此这种π-π相互作用在甲醇中是不存在的，但在乙腈中却很可能发生，并且由于这种额外的相互作用，苯甲酸将更喜欢存在于乙腈的流动相中。因此，它将随着流动相一起流动，因此更快地洗脱出来。为什么对甲苯甲酸的保留时间较长？
烷基链的存在将疏水性带入分子中，如果疏水性存在，则可以通过疏水相互作用与C18固定相发生相互作用。现在，在苯酚、苯甲酸中没有烷基链的存在，但是在对甲苯甲酸的情况下，有一个甲基链，这个甲基链带来了一点疏水性，因此会与C18等疏水性固定相发生相互作用，这导致对甲苯甲酸与固定相之间有很好的相互作用，因此会保留更长时间。
将乙腈＆甲醇与缓冲液混合产生的沉淀
在反相液相色谱中，缓冲液与有机溶剂的流动相混合使用，此时有机溶剂的浓度过高可能会导致缓冲盐沉淀。上表中，分别展示了常用缓冲液与乙腈或甲醇混合后是否会沉淀的情况。我们可以看到，对于某些缓冲液，无论使用哪种有机溶剂都不会发生沉淀，但通常情况下，在甲醇条件下产生沉淀的情况较少。
与水混合产生的反应热
当甲醇与水混合时，会放出热量；
当乙腈与水混合时，会吸收热量；
随着乙腈混合物逐渐回到室温，液体中会产生气泡；
甲醇与水混合时会产生热量，具有脱气效果；
配制水和甲醇混合物作为流动相时需要的关注比乙腈更少。
有时单用ACN或MEOH可能会达不到理想的分离效果，在流动相同时使用ACN和MEOH可改变选择性以获得较好的分离效果。
简言之，在改变分离选择性的时候，甲醇细调，乙腈粗调。主要是为了调整流动相的粘度和强度，使得分离效果和选择性有所改善。
