由于单克隆抗体对靶点的特异性，其在自身免疫性疾病或癌症中的重要性日益增加[1]。重大的技术进步使得用于疾病治疗的单抗的发现和发展更快、更有效，双特异性抗体和偶联抗体等单抗新剂型的开发，进一步增加了该类药物的研究热度[2]。单抗溶液通常根据市场需求转化为药品，如何稳定的储存是保证抗体溶液转化为有效和安全药品的关键步骤。为降低开发和储存成本，并提高治疗效果[3]，学者们针对影响抗体储存稳定性的因素进行了研究，包括抗体分子自身性质、环境应力和储存方式等因素。其中储存方式因素中的容器和储存温度均对抗体的质量有重要影响，本文通过对比不同容器和冷冻储存方式，希望为选择高效、低成本、保证质量稳定的抗体原液储存方法提供新思路。
1、容器
容器看似是生物制药生产的一个次要方面，但因与抗体溶液直接接触，故容器质量等相关性质是影响抗体药物原液活性和免疫原性的重要因素。
中国药典对容器有以下要求：直接接触药品的包装材料和容器应符合国务院药品监督管理部门的有关规定，均应无毒、洁净，与内容药品应不发生化学反应，并不得影响内容药品的质量。容器需要防止可能改变产品性能的不利外部因素的产生，包括湿度、光线、氧气和温度变化、生物污染、物理损坏和泄露。研究发现容器会影响抗体的稳定性和安全性，即它们与抗体发生相互作用[4-6]。例如在储存过程中，容器内容物与抗体的相互作用会导致可提取物和可浸出物的产生，是导致安全损害的重要属性[7]。因此需要谨慎选择抗体药物的储存容器，主要从容器材质、可浸出物和可提取物以及容器的灭菌方法方面进行比较及选择，以降低与药物的免疫原性相关的风险。
1.1 容器材质
1.1.1 不锈钢
在抗体药物的生产和储存过程中，容器可分为三类：不锈钢、瓶子和袋子。不锈钢是一种典型的接触材料，被广泛用于生物制品的制造、运输和储存，其中含镍不锈钢是冷冻原料药长期储存的一种重要、节省成本的材料，其表面光滑、易于清洗、消毒和去污垢。常用的类型是奥氏体不锈钢 316L，是不锈钢 316 的低碳配方[8]。奥氏体 316 型很容易制成复杂的工艺机械，但具有易腐蚀和导致药品被污染的缺点，6%钼不锈钢的耐腐蚀性能优于奥氏体316 型。镍-铬-钼化合物在酸性或者碱性环境中均有良好的耐腐蚀性。以哈氏合金（C276 或C22）为基础的金属容器具有耐腐蚀性，铁含量低等优点，因此有时会选择以哈氏合金为基础的金属容器，从而可以减轻高盐配方带来的潜在腐蚀风险，如长期暴露于低 pH 或某些离子（如氯化物）的腐蚀槽。
1.1.2 塑料容器
由于塑料具有化学惰性，因此被广泛应用于医疗。塑料容器是通过加热、加压、添加催化剂和增塑剂等工艺将重复单体单元有序聚合而得到的，它们的性质和制造过程允许调节不同的功能，如灵活性、水分渗透、透明度、可折叠性与热灭菌的兼容性[5]。常用的聚合物有：聚乙烯（Polyethylene，PE）、聚氯乙烯（Polyvinyl chloride，PVC）、聚丙烯（Polypropylene，PP）、聚酰胺（Polyamid，PA）、聚碳酸酯（Polycarbonate，PC）、低密度聚乙烯（Low DensityPoly-Ethylene，LDPE）、高密度聚乙烯(High Density Polyethylene，HDPE)、共聚酯（Poly(ethylene terephthalateco-1,4-cylclohexylenedimethylene terephthalate)，PETG）和乙烯-醋酸乙烯共聚物（Ethylene-vinyl acetate copolymer，EVA）。PVC 是第一种用于制造可折叠容器的聚合物，除可湿陷性和透明度外，在其他的性能测试中表现很差。一般在聚合材料中使用添加剂，以满足实际需求，其中增塑剂邻苯二甲酸二辛酯（Di-(2-ethylhexyl Phthalate ，DEHP)的存在限制了储存在 PVC 中的液体类型，因为增塑剂会浸出到所含药品中。考虑到 DEHP 的长期安全性，一些国家已经禁止使用 PVC 材料，用 EVA 和 PP 取代 PVC 以避免增塑剂的不必要迁移，具体聚合物的性能比较见表 1。
1.1.3 一次性容器
用于生物制药的一次性塑料生物容器的使用率在逐渐增加。EVA 薄膜的开发改善塑料的相容性和透湿性等特性。EVA 是一种随机共聚物，其性能取决于醋酸乙烯（VA）含量和分子量。VA 含量为 3%~12%的 EVA 的设计灵活性与塑化 PVC 相似。聚烯烃可以在不使用增塑剂的情况下进行调整，但可能需要其他性能的添加剂。虽然 EVA 不含增塑剂，但和 PVC一样，它的防潮性能较差，而且这种单层袋都需要二次包装。多层膜的研制解决了水分的渗透问题。乙烯-乙烯醇共聚物（EVOH）具有高的气体屏障，被用作核心，作为两层 EVA 之间物理连接[9]。与非一次性塑料容器相比，一次性容器具有多个优势，包括增加工艺灵活性和便利性、减少滞留体积、降低清洁验证成本以及降低交叉污染风险[10-11]。容器壁的横截面通常由几个不同的共挤层组成，包括流体接触层，气体阻挡层，胶粘层和提供机械强度和保护的外层。虽然流体接触层可以由惰性材料构成，但是来自其他层的浸出物可能迁移到储存溶液中。一次性容器的疏水性导致可浸出物会吸附在液-固界面，从而会影响抗体质量。尤其是在溶液中蛋白质的聚集和颗粒的形成，这可能会导致对免疫原性的额外关注[12]。
目前市场上主要的一次性袋子有：
（1）RoSS 外壳用于保护一次性生物容器，保护药品并实现快速冻融，以便后续运输和处理。
（2）Flexsafe 袋子，采用高性能聚乙烯膜制作，S80 薄膜的厚度、强度和韧性提高袋子的机械强度，Flexsafe 的强度降低因操作不当导致袋子意外破损的风险，并且 γ 辐照后无老化效应。
（3）Celsius® FFT 和 Celsius® FFTp 容器，以 LLDPE 和EVOH 为骨架，以 LLDPE 为接触层，较高的韧性可以安全方便的冷冻和解冻。具体见图 1。
1.2 容器相关的可浸出物和可提取物
塑料是可提取物和可浸出物的最大来源。在使用这些塑料时，存在 3 个常见问题：
（1）渗透，即蒸汽和其他分子在容器壁的任意方向的渗透；
（2）浸出，即塑料成分浸出到产品；
（3）吸附，即塑料材料上的药物分子或离子吸附。
渗透是最广泛的问题之一，通过允许挥发性成分、水或特定的药物分子迁移通过容器壁，从而导致容器内容物的损失。当塑料配方中的某些成分迁移到产品中，如增塑剂或抗氧化剂，浸出可能是一个问题。浸出物质的特性及其积累水平可能会影响储存在容器中的产品的最终效用[13]。因此，塑料聚合物配方应有较少的添加剂。吸附是一个选择性问题，即少量药物分子的吸附发生在特定的聚合物上。已有研究表明，单克隆抗体可以吸附塑料等材料[14-15]。水分流失：储存过程中水分的流失反向渗透也可能发生，塑料材料具有较高的透气性，氧气或其他分子渗透到容器内部，导致易感成分氧化或降解。对不锈钢来说，重点考虑金属离子的影响。金属离子可以从药品或与设备接触的产品中滤出，一些塑料包装、玻璃瓶、橡胶塞子也可能是金属渗透液的来源。缓冲液种类、每单位不锈钢接触表面积的测试介质填充量、配方辅料如金属螯合剂类型和浓度、pH 储存温度和不锈钢接触时间等因素对金属离子浓度有重要影响。
1.3 容器的灭菌方法
容器材料和添加剂在 γ 辐照杀菌过程中的降解是可浸出物的另一个重要来源[16]，须关注灭菌方法对容器性能的影响，方法有蒸汽灭菌、热力灭菌、γ 辐照、气相灭菌法、紫外线照射法。蒸汽灭菌是减少蛋白质氧化的最佳方法，但许多材料在热力灭菌条件下会软化或熔化，因此必须对环氧乙烷或其降解产物的残留物及其潜在的毒性作用进行仔细的评估。γ 辐照会对塑料的外观和产品的稳定性产生负面影响，一些 PP 配方经辐照后会发生降解[1]，PVC经辐照会导致颜色从透明到黄色的变化，pH 值变化和可萃取物的增加。具体聚合物的性能比较见表 2。
上述分别讲述了容器的材质、可浸出物和可提取物、容器的灭菌方法对抗体药物的稳定性的影响，可以看出不锈钢具有耐用、容量大等优点，但较重，不易操作，且耐酸碱腐蚀性较瓶子或一次性袋子较差，同时会有金属离子的浸出；瓶子是使用较多的一种药物容器，具有成本低、可靠的优点，但添加剂带来的可进出和可提取物较多；一次性袋子是较新的药物容器，具有高灵活性，同时具有较少的可浸出物和可提取物，耐酸碱性比较好，重量轻，易于操作和挪动，但成本相对瓶子来说比较高。具体的容器的比较见表 3。
2、低温储存
储存过程中的温度对抗体药物的质量有着至关重要的影响。对降解途径的研究表明，抗体在低温下降解较慢，因此低温储存是延长货架期的一个很好的选择[18]，同时降低生产过程中的投入资本。低温储存包括两个步骤：一是冷冻，抗体药物在零下温度下转变为固态；二是解冻，抗体药物在储存过程结束时回到室温。在实际应用过程中主要通过不受控速率冷冻和受控速率冷冻两种方式实现抗体药物的低温储存。
2.1 低温储存的方式
低温储存的方式有不受控速率和受控速率方式。不受速率的冷冻是将含有抗体药物的容器放入温度控制单元中，直到物料达到设定温度值。最简单、直接的方式是将适当大小的瓶子储存在冰箱中，这种瓶子通常由聚丙烯或聚乙烯制成。控制速率冷冻是一种越来越常用的冷冻方法，此种方法是将药物容器被放置在一致的传热去除条件下。冷冻方式被认为是影响蛋白质降解的潜在因素[19-20]。冷冻过慢会导致低温浓缩效应加剧，蛋白和赋形剂在冰晶形成的前沿附近产生浓度梯度，并被排除在冰-液界面之外。这会导致组分之间出现pH 值变化和相分离，从而导致蛋白质结构损坏。在冷冻过程中，冰晶形成时移动的冰峰会排除溶质分子，可能会发生蛋白质溶液的低温浓缩，导致蛋白质集中在浓度较高的区域[21-23]。解冻是冷冻的盛有药物的容器被放置在环境条件下（冰箱或室温）直到完全液化，在没有主动控制的情况下，解冻时间取决于容器大小，若没有摇动或搅拌，每个容器都会存在显著的浓度和温度梯度。主动控制系统目前仅限于不锈钢、合金和 EVA 多层袋。
受控速率系统：
（1）Cryo Fin-Cryovessel 可控冻融系统，CryoFin 由冷冻罐，热控制单元和搅拌器组成。规格包括 20、60、125、200、300 L。由不锈钢及其合金材质组成所以比较耐用。冻融过程重现性比较好，保证密封性。
（2）RoSS pFTU 板式冻融系统，分为实验室级、小规模、大规模和超大规模。RoSS pFTU 超大规模冻融系统将取代 CryoVessel 不锈钢冻融系统，不同于一次性工艺，后者现用于超大体积的生产。
（3）东富龙立式堆叠冻融系统，自定义设置冷冻和解冻工艺。
（4）Celsius® FFTp-卧式冻融系统：容器组装完整，适用于卧式平板冻融器。专为卧式平板冻融器而设计。板子均是透明便于查看和检查袋室。不受控速率系统的优势主要是操作简单方便，主要有普通冰柜和冰箱。
主要外观见图 2。
2.2 低温储存的影响因素
尽管低温储存可以延长货架期，但如何实现低温方面需要考虑一些问题。
（1）容量。不受控系统受储存和各种处理因素的限制，目前表明最大容量为 20 L/瓶。受控系统从 2.1 L（最小袋容量）到 300 L（不锈钢罐）不等。
（2）储存温度。不受控系统可加工至－70 ℃或－80 ℃并储存，可用的冰柜可容纳大多数尺寸。对于塑料为基础的容器，在处理时必须充分考虑在这种温度下的脆性。受控系统可以在－50 ℃进行加工，而不锈钢系统的操作储存可能也仅限于相同的温度。一次性袋子可以储存在－70 ℃或－80 ℃，由于可能易碎，有一些处理问题。
（3）成本。在－20 ℃以下的储存，由于涉及的尺寸和体积，任何类型的系统都需要特定的设施。考虑容器是一次性还是可重复使用的，当使用一次性容器时，必须解决其成本和处置问题。
（4）容器。容器的设计直接影响其清洁度，容器应完全排水，避免尖角和积水区域。受控速率系统可能需要多个容器来储存一批溶液，因此涉及多个容器关闭，这意味着会增加污染的风险。由于沉积物的负载或腐蚀物的集中促进金属的点蚀，因此使用不锈钢或瓶子容器需要大量的维护、验证和清洁程序。一次性袋子在这方面是有利的，但必须考虑处理和废物管理的成本。一次性袋子在经济、方便和质量方面超过传统的不锈钢和瓶子，由于产品交叉污染的风险以及清洁验证的成本，这些因素共同促使制造商远离固定设备，转而拥抱一次性技术。
不受控系统的优点是简单、重量轻、节省成本，缺点是包括缺乏主动过程的控制和容器之间的潜在变异性，室温下将多个容器装载到冰箱容易超过其冷却能力。虽然对于不受控速率的冻融，总有一些控制措施，如温度设定点，但还有其他几个因素可以影响冻融过程和达到设定点温度所需的时间，包括传热速率、流体流道长度、空气流速、冷冻器容量和解冻步骤的搅拌，这些不受控制的冻结和解冻速度的因素会随着运行的不同而不同。如果配方中的蛋白质在广泛的冻融条件下稳健且稳定，并且可以承受低温浓缩，这是许多公司首先选择的运营模式。受控速率系统，可以使冷冻和解冻的抗体药物浓度更加均一，使蛋白质更稳定，有稳定的性能可扩展与可重复性的热分布方面，相比非控制速率系统，减少时间成本，但由于需要特殊设备，所以成本相对较高，并且受到特定设备的可用性和集装箱的尺寸限制，它的容量可能受到限制[24]，为保证抗体药物质量的稳定性，较多公司会选择控制速率系统。不同储存系统的比较见表 4。
3、结 语
研究表明，抗体溶液在固体和液体状态下保持的时间越长，聚集的机会或倾向其他降解途径的机会就越大，会导致抗体药物的稳定性受到影响。在影响抗体稳定性因素中储存容器和储存系统的变化是重要影响因素之一，因此选择一个合理的储存方式，对蛋白质的质量稳定是至关重要的，上面列出了储存容器和储存方式的优缺点，为抗体药物更稳定地储存提供理论支持。
