近期，香港理工大学郑子剑、赵昕教授和华东理工大学刘昌胜院士团队在科爱创办的期刊Bioactive Materials上发表了一篇以《人工纤毛用于BMP-2在生物材料表面的共价固定》为题的文章。文章报道了一种共价固定策略，在材料表面原位生长出聚合物刷后将其与骨形态发生蛋白-2（BMP-2）化学键合，成功构建了高活性骨修复材料，该材料在颅骨临界尺寸缺损动物实验中展示了比物理吸附BMP-2组表现出更好的成骨效果。这种策略可以应用于局部控制生物大分子偶联，为各种组织的加速再生提供了新方案。
目前，原位固定并保持生长因子的生物活性（如骨形态发生蛋白-2）仍然是一个巨大的挑战，作者采用了一种柔软而稳定的表面改性策略来解决此问题。作者将BMP-2共价固定在均质聚甲基丙烯酸甘油酸酯(PGMA)聚合物刷上，该聚合物刷通过表面引发原子转移自由基聚合反应（SI-ATRP）接枝到了基材(金片、石英玻璃、二氧化硅晶片等)表面。这种表面修饰方法不仅增加了功能化界面面积，还具有简单、快速、温和的特点；共价固定化后的BMP-2构象和二级结构均保存良好。此外，在均质PGMA聚合物刷表面固定的BMP-2 (i-BMP-2)表现出了优异的生物活性(与对照组体外游离BMP-2相比，生物活性保持在其87%左右，比体内游离BMP-2支架的生物活性高20%-50%)。PGMA聚合物刷可修饰不同组织工程支架的表面，促进生长因子的原位固定，提高材料表面的生物活性，加速多种类型组织的修复。
一、PGMA聚合物刷的制备及BMP-2的固载
首先在金片表面引入SI-ATRP引发剂，引发GMA单体在金片表面“生长”成大分子刷状结构。之后利用PGMA刷上的环氧基团与BMP-2的氨基发生的开环反应，将BMP-2共价耦合到材料表面（图1a）。AFM图像（图1 b-d）显示，经过PGMA表面改性的金片表面粗糙度出现明显增加，BMP-2固定化后粗糙度略有提高。拉曼光谱（图1e）和XPS（图1f）结果表明，BMP-2的固定改变了PGMA表面的化学成分,说明BMP-2在PGMA聚合物刷上成功耦合。
图1 BMP-2在PGMA表面的固定及PGMA和PGMA-BMP-2的表征
二、PGMA-BMP-2的生物相容性研究
作者将PGMA聚合物刷以及PGMA改性并固载BMP-2的不同基材与小鼠成肌细胞C2C12共培养，发现各基材表面的PGMA聚合物层均具有良好的生物相容性。荧光染色（图2c）图像表明PGMA聚合物刷有利于细胞黏附和扩展，同时还表明固定化的BMP-2有抑制C2C12的增殖而促进其向成骨细胞分化的趋势。
图2 PGMA聚合物刷层的生物相容性
三、固定化BMP-2的成骨活性研究
通过C2C12细胞共培养ALP染色研究PGMA聚合物刷上固定的BMP-2（i-BMP-2）的成骨活性。通过定量ALP活性测定和定性ALP染色实验（图3 a-b），作者发现i-BMP-2培养的C2C12在溶液中的ALP活性高达游离BMP-2培养的C2C12的ALP活性的87%，这说明PGMA聚合物刷上的BMP-2保持了相当高的成骨生物活性。作者还发现，PGMA-BMP-2在用细胞裂解液或酒精浸泡处理后仍可保持BMP-2的生物活性（图3c-d），固定在不同底物上的BMP-2培养的C2C12的ALP活性在82%至88%之间（图3e）。最后的圆二色谱结果也证实了i-BMP-2的二级结构未发生改变，说明PGMA聚合物刷可有效保持BMP-2的成骨生物活性。
图3 固定化BMP-2（i-BMP-2）的成骨活性
四、PGMA聚合物刷固载BMP-2促进体内成骨
随后，作者又利用大鼠颅骨临界缺损修复实验验证PGMA聚合物固载BMP-2的体内成骨效果，Micro-CT（图4a）及定量结果（图4 b-c）显示，PGMA聚合物刷更有利于成骨相关细胞在体内的粘附，加速相关的成骨过程，且其固定的BMP-2不仅在体内保持了良好的生物活性，还表现出更好的成骨效果和更长的效果持续时间。组织切片结果（图5）和免疫组织化学分析结果均表明，使用PGMA聚合物刷固载的BMP-2在体内具有更好的成骨效果。
图4 PGMA聚合物刷固载BMP-2的体内促成骨效果
图5 Masson三色染色法对6周和12周骨再生切片组织学评价。(NB:新骨;CB:松质骨;F:纤维组织;M:材料;BM:骨髓;CC:软骨)
上述体外实验结果表明，PGMA聚合物刷固定的i-BMP-2能够维持BMP-2的生物活性。与溶液中的BMP-2一样，i-BMP-2可以迅速与细胞表面的特异性BMP-2受体（BMP-R）结合，激活下游Smad信号通路，增强成骨相关基因的表达，促进成骨（图6）。
图6 PGMA固定化BMP-2 (i-BMP-2)和游离BMP-2在成骨细胞分化中的作用机制
综上所述，文章作者成功开发了一种用于原位固定BMP-2的PGMA聚合物刷表面改性层，该改性层可用于多种材料（金片、石英玻璃、3D打印多孔支架等）的表面修饰，并在高效固载BMP-2的同时维持BMP-2的促成骨活性。该项目为提高传统骨修复材料的成骨活性，加速骨组织的再生与修复提供了一种简单有效的策略。
原文信息：Qi Gan, Lina Chen, Ho-Pan Bei, Sze-Wing Ng, Han Guo, Guoqiang Liu, Hao Pan, Changsheng Liu, Xin Zhao, Zijian Zheng.
Artificial cilia for soft and stable surface covalent immobilization of bone morphogenetic protein-2.
Bioactive Materials, 24 (2023) 551-562.
