LCMS-8050为例
三重四极杆液质联用仪是通过液相的分离技术使化合物进行分离、质谱的离子化技术将待测物质成分转化为离子(正离子和负离子)，在四极杆部分对不同质荷比(m/z)的离子进行区分，将样品离子信号转换成电子脉冲计数，计数的大小与分析样品中离子的浓度成正比，通过与已知的标样或参考物质比较最终实现未知样品的定量分析。
一个优秀的液相质谱定量方法，不仅应该考虑液相系统分离度，也应兼顾质谱系统检测灵敏度。本文以岛津LCMS-8050仪器为例，探讨定量方法的建立与优化。
一、 实验准备
1、接通电源，启动工作站
双击电脑桌面上的“LabSolutions”图标，等待，直到出现下面的界面：
输入用户ID和密码，点击“确定”，进入主项目。进入主项目后，首先在新出现的窗口中点击左侧的“仪器”，再双击右侧的对应的仪器型号图标，进入分析界面。
2、维护进样器与溶剂管理器
（1）自动进样器清洗
点击分析界面上方工具栏图标中的“自动进样器清洗”，执行自动进样器清洗。反相色谱清洗液为甲醇水溶液(50:50，V:V)；正相色谱清洗液使用与流动相一致的溶剂；离子交换色谱清洗液为纯水。
（2）排气
对泵和自动进样器两部分进行排气。排气的方式又分为手动排气和自动排气，实际操作时，只需执行其中一种排气方式。将配制好的流动相放在流动相托盘上，确保输液泵的吸滤头浸没在对应的流动相液面以下。
手动排气（面板控制）：旋开液相色谱输液泵的排气阀旋钮（旋开180º即可），按下对应泵单元面板上的“purge”键，进行排气操作。排气完成约需时3分钟，之后请关闭排气阀旋钮。自动进样器排气只需按下左侧面板上的“purge”键即可；耗时约25分钟。
自动排气（工作站操作）：在LabSolutions工作站实时分析界面的仪器参数视图中，选择“自动排气”项，在下拉菜单中选择需要排气的流动相，同时勾选“自动进样器”。设置完成后，点击“下载”。
然后点击分析界面上方工具栏图标中的“自动排气”，执行自动排气。
二、 连接两通，建立MRM方法
定量工作一般采用MRM 模式，对于目标化合物首先需要建立化合物的MRM 分析方法。
1、Q1/Q3 扫描
（1）配制一定浓度（例如1000 μg/L）的目标化合物单标或者混标，通过自动进样器进样，进样体积1 μL。Q1/Q3 同时扫描正负离子的目标前体离子，可正负离子同时扫描。
“Start m/z（测定开始m/z）”和“End m/z（测定结束m/z）”：根据目标化合物的分子量自行设置合适范围。
“Acq. Time（测定时间）” “Data Acquisition（数据采集时间）”一致，均修改为0.5 min
“Pump（泵）”部分选择“Binary gradient（二元高压）”，“Total Flow（总流速）”0.4 mL/min，“Pump B Conc.（泵B 浓度）”有机相80%
“Column Oven（柱温箱）”前的“√”去掉
“Autosampler（自动进样器）”将Rinse Type（清洗类型）改为“External Only（清洗针外壁）”
以上条件设置完成，保存方法，单击快捷键“
”，然后按“Download”键。
单针/批处理进样分析。
（2）数据结果查看
打开Postrun（再解析）窗口，打开数据文件，使用“Average Spectrum（谱图平均）”工具，查看某段时间内的平均质谱图，找到目标化合物的[M+H]+或者[M-H]-及加合离子信息，根据分析结果选择合适的前体离子。
2、利用产物离子自动搜索的方式优化
（1）单击“Optimization for Method（优化方法）”，弹出的对话框中选择“Optimize MRM event from product ion（利用产物离子搜索进行优化）”作为优化方式。在弹出的对话框中，依次输入“Compound Name（化合物名称）”、“Precursor m/z（前体m/z）”、“Start(min)（开始（min））”0min、“End(min)（结束（min））” 0.5 min、“Vial（样品瓶）”、“Tray（样品瓶架）”、“Inj Vol.（进样体积）” 1.0 μL等信息。鼠标左键点击“Start（开始）”，开始MRM 优化过程。
（2）利用产物离子搜索完成一个化合物的MRM 优化需要4步，通常2分钟内可以完成一个化合物的优化，若时间过长，建议Stop 整个优化过程，检查End (min)是否修改为0.5 min（默认为10 min）。
三、 连接色谱柱，建立液质方法
1、加载MRM方法
将“二”优化好的MRM 参数加载到新建方法中。找到MRM 方法文件所在的文件夹，选中所有需要的MRM 方法文件。修改“Acq. Time（测定时间）”为分析一个样品所需的时间，例如0-10 min。
2、建立色谱分离条件
常用的有机相包括甲醇和乙腈，甲醇作为质子化溶剂（氢键供给者）洗脱能力较弱、粘度较、高，乙腈反之。醋酸/乙酸铵、甲酸/甲酸铵、氨水为常见的流动相PH调节剂。在初步确定的液相方法适宜pH值与溶剂条件后，我们将筛选不同色谱柱的分离效果、优化流动相梯度、调节柱温箱温度等。
（1）液相梯度条件设置
液相色谱的初始条件在Pump（泵）选项卡中依次设置：二元高压系统选择“Binary gradient（二元高压梯度）”，设置“Total Flow（总流速）”、初始浓度“Pump B Conc.（泵B 浓度）” 如果采用线性梯度则默认0、最高压力限“Maximum”设置为100。Pump（泵）选项卡设置后，在梯度表格中设置时间程序。
（2）柱温设置
选中“Column Oven（柱温箱）”复选框，在“Oven Temperature（柱温箱温度）”中，设置柱温。CTO-20A/20AC、CTO-30AS柱温箱最高温度90℃，CTO-30A柱温箱最高温度160℃，也可设置为色谱柱的最高使用温度进而保护色谱柱。
（3）保存方法
整体方法编辑完成后，保存方法，同时下载方法，平衡仪器。
四、确定色谱柱，优化液质方法
LC-MS方法开发时，除考虑液相分离度，也要尽可能提高质谱检测灵敏度。如图，酸性流动相（甲酸水）能增加质谱正离子模式的灵敏度、降低负离子模式的灵敏度，碱性流动相（乙酸铵）反之。
1、优化脱剂管温度
可调节脱溶管温度影响目标化合物电离，操作者可对比200、250、300 deg.C的灵敏度，得到最佳脱溶管温度参数（如图最佳温度为300）：
2、优化Interface（接口）参数设置
可设置多通道检测，分别筛选0.25、0.5、1.0、2.0 kV接口电压的灵敏度。
3、调整喷雾针位置
喷雾针距离离子源越远，响应灵敏度降低。在实验中一般默认其x轴位置为+1（即伸出1mm），但是否为目标化合物最佳喷雾针位置，需要手动调整加以验证。这里需要注意的是，除喷雾针的位置外，其他参数均可以通过软件反控，因此可以使用批处理的方法进行优化。
液相质谱定量方法的开发，实质就是在保持各组分色谱峰良好分离度的前提下，兼顾各目标化合物的高响应灵敏度。流动相溶剂、流动相pH、色谱柱是影响液相分离效果的主要因素，MRM电压、脱溶剂参数、喷针位置是影响质谱灵敏度的主要因素，当分离度和灵敏度冲突时我们要优先满足分离度。
简而言之，液相质谱定量方法的建立与优化一般包括以下四步：一、实验前准备，保证系统正常运行；二、连接两通，优化MRM电压，建立MRM方法；三、筛选色谱柱，建立良好液相分离方法；四、在兼顾液相分离度同时，优化质谱检测灵敏度。希望今天的分享能够对大家有所帮助，期待您的点赞评论。
