为了增进对该法规指南的直观操作体验，本文参考Potiwa Purazi等的《Assessment of “Sameness” and/or Differences between Marketed Creams Containing Miconazole Nitrate Using a Discriminatory in vitro Release Testing (IVRT) Method》的数据，并按照FDA的SUPAC-SS指南中的“相同性”验收标准对两种已上市的非专利产品进行了测试和评估，以此展示IVRT工具如何用于半固体制剂体外释放研究及其后续的处方筛选工作，提供一个模拟真实运用场景的操作实例给广大研究同仁参考。
1、研究中使用的物料与方法
1.1.物料
1.1.1.化学试剂与参考标准品
氢化可的松（HC）标准品
硝酸咪康唑（MCZ）标准品
硝酸益康唑（ECZ）标准品：内标物
已上市的氢化可的松霜Emo-Cort 1%：GlaxoSmithKline Inc，用于性能验证测试（PVT）。
参比制剂Daktarin®霜（2%）：Janssen Pharmaceutica，用作参考产品，以开发和验证IVRT方法。三种含有1%、2%和4%MCZ的特制霜配方也用于确认IVRT方法的灵敏性、特异性和选择性。
经批准且已上市的仿制配方Dermazole®霜剂（2%）：Sandoz公司，与参比制剂进行比较，以证明该方法用于评估“相同性”和/或检测差异。
经批准且已上市的仿制配方Covarex®霜剂：与参比制剂进行比较，以证明该方法用于评估“相同性”和/或检测差异。
1.1.2.HPLC 色谱法
使用液相色谱法进行测试样品的含量检测，用于分析PVT和IVRT样品的HPLC系统配备了Waters Alliance 2695型分离模块，该模块包括在线脱气模块、自动取样器和光电二极管阵列（PDA）检测器
Waters®Empower 3软件用于数据采集和处理。使用METTLER®AE 163型分析天平对参考标准品和霜进行称重。P100和P1000微量移液管用于转移和稀释标准溶液和样品溶液，液相色谱测试条件见下表：
表1 液相色谱测试条件
|
API名称
|
氢化可的松（HC）
|
硝酸咪康唑（MCZ）
|
|
色谱柱
|
Phenomenex Luna C18（2）5µm（150×4.6 mm）
|
Phenomenex Luna C18 5µm（150×4.6 mm）
|
|
流动相
|
水：乙腈（70:30 v/v）
|
乙酸铵缓冲液（0.005 m）：乙腈（用0.1%磷酸调节）（25/75 v/v）
|
|
流速
|
1 mL/min
|
1 mL/min
|
|
检测波长
|
254 nm
|
226nm
|
|
内标液
|
N/A
|
ECZ
|
1.1.3.IVRT 测试系统
使用基于Franz扩散池原理的透皮系统进行方法开发，膜暴露表面积为1.767 cm²，供体室和受体室由选定的合成膜隔开。
1.2.方法
1.2.1.HPLC 方法验证
根据国际协调委员会（ICH）关于线性和范围、精密度、重复性、准确度、特异性以及确定的定量限（LOQ）和检测限（LOD）的指南，验证IVRT样品定量的HPLC方法。
1.2.2.测试设备的机械验证
作为机械验证的一部分，评估了VDC的容量和直径、接受介质的温度、搅拌速度、上样的样品体积以及VDC系统所处的环境条件。根据USP<1724>要求对VDC进行机械参数确认。
验证中需要计算单位面积采样时间释放量所需的每个VDC的孔的直径和容量分别通过测量长度和重量确定。使用重量法评估每个VDC的容量。用游标卡尺测量孔的直径确定膜暴露面积。
温度保持在32±1°C，以模拟皮肤温度并避免扩散系数的变化。在用纯化水填充VDC并平衡30分钟后，用经过校准的数字温度计测量六个VDC中的接收介质温度，确认温度达到预设要求。
使用激光转速表在500rpm下评估六个VDC之间的搅拌速度准确性与均匀性
所有物理参数测量3次。根据预定义的验收标准，计算平均值（x）和变异范围（V），以确定六个VDC的准确性和测试池之间变异性。机械验证的验收标准根据USP通用<1724>。
1.1.3.性能测试 (PVT)
使用1%氢化可的松（HC）进行PVT测试，测试条件如下：
表2 PVT测试条件
|
药物名
|
1%氢化可的松（HC）Emo-Cort®
|
|
上样量
|
300mg霜，伪无限剂量
|
|
接收液
|
乙醇：水（30/70 v/v）
|
|
膜预处理
|
将膜放在接收液中孵育30min
|
|
搅拌速度
|
500 rpm
|
|
温度
|
32±0.5°C
|
|
是否封闭上样
|
Yes
|
|
取样点
|
0.5、1、2、3、4和6小时
|
|
取样量
|
200 µL
|
|
取样方法
|
部分取样
|
1.2.4.硝酸咪康唑（MCZ）接收液研究
评估MCZ在pH 4.5接收液（50/50 v/v）（乙醇：0.05 M磷酸盐缓冲液）中的溶解度，一式三份。称量药物并放入空VDC中，加入接收液以获得饱和浓度。将MCZ溶液在32±0.5℃下搅拌6小时。然后停止搅拌，样品静置过夜。提取上清液的等分试样，过滤、稀释并分析，以确定溶解的MCZ的浓度。理想情况下，在整个IVRT过程中，药物在接受液中的溶解度应大于药物最大预期浓度的10倍。
1.2.5.膜筛选实验
使用各种合成膜进行膜筛选，例如Magna Nylon、Tuffryn，乙酸纤维素，纤维素酯和Strat-M。通过在32±1°C下，将每个单独的膜浸入含有250µg/mL MCZ的10mL测试溶液中，在pH 4.5接受液（50/50 v/v）（乙醇：0.05M磷酸盐缓冲液中，以一式两份的方式研究MCZ在各种膜上的结合。平行评估了一组无膜对照MCZ溶液。可能存在因为药物与膜的结合和/或其在接收液中的稳定性，为了确定MCZ含量的任何变化，使用上述HPLC方法测定所有测试溶液的浓度。此外，进行了IVRT试验，以比较两种膜（尼龙膜和Tuffryn膜）的释放情况。
1.2.6.硝酸咪康唑（MCZ）IVRT 方法设计
硝酸咪康唑（MCZ）设计的测试条件见表3：
表3 硝酸咪康唑（MCZ）IVRT方法设定
|
药物名
|
硝酸咪康唑（MCZ）
|
|
上样量
|
~300mg霜，伪无限剂量
|
|
接收液
|
磷酸盐缓冲液：乙醇（50:50 v/v），脱气后使用
|
|
膜预处理
|
将膜放在接受液中孵育30min
|
|
搅拌速度
|
500 rpm
|
|
温度
|
32±0.5°C
|
|
是否封闭上样
|
Yes
|
|
取样点
|
0.5、1、2、3、4、5和6小时
|
|
取样量
|
200 µL
|
|
取样方法
|
部分取样
|
智能真空脱气仪
1.2.7.释放速率计算
使用Higuchi模型，假设存在完美漏槽条件且在伪无限剂量下，使用方程（1）确定释放率。考虑到由于替换取样量而导致的接收液稀释，并使用方程（1）计算不同取样时间下接收液中MCZ的浓度（Cn）。
式子中,
Qn ： 单位面积在时间（n）释放的量，单位为µg/cm²
Cn ：不同取样时间下接收液中的药物浓度（n），单位：µg/cm3
Vs ：样品体积（cm³）
Vc ： 扩散池体积（cm²）
Ac ：膜暴露面积（cm²）
释放速率则为Qn与时间平方根曲线的回归线斜率，参见USP< 1724>
1.2.8.IVRT方法验证
线性、精密度和重现性
使用参考产品Daktarin®霜（2%）进行了三次IVRT试验，在不同天测试（n=6），以确定线性、精密度和重现性。为了符合Higuchi模型的假设，单位面积的释放量应与时间的平方根呈线性关系。
通过使用方程（2），从获得的18个释放率中估算实验内和实验间的变异性来确定精密度和重现性
式子中, µ = 估计平均释放速率
σ1 ： 实验间标准偏差
σ2 ：实验中标准偏差
灵敏度、特异性和选择性
IVRT方法的灵敏度、特异性和选择性，在VDC（n=6）的三次IVRT试验中进行了评估，每个VDC使用含有1%、2%和4%MCZ的霜，这些霜是特别配制和临时制备的。通过测定释放速率随MCZ浓度的变化，验证IVRT方法的灵敏度，并通过评估释放速率与测试产品中MCZ浓度的比例来表征特异性。以释放速率为因变量，以MCZ浓度为预测变量的线性回归模型用于估计确定相关系数（R²）。
为了测试IVRT方法是否有选择性，以准确辨别产品性能差异，使用USP< 1724>章节中描述的统计方法，将含有2%MCZ的霜与具有较高和较低MCZ浓度的测试产品进行比较。此外，IVRT方法准确证明“相同性”的能力，通过Daktarin®霜（2%）与自身的两两比较进行测试。
耐用性
分别在30°C和34°C下评估了该方法在标称温度（即32°C）下对微小波动（±2°C）的耐用性。
剂量消耗
为了确保IVRT实验期间没有过量的剂量消耗，能够使用线性、精密度和重现性测试的结果，应计算产品的剂量消耗，确保为伪无限剂量，伪无限剂量以回收率Recovery表示，使用方程（3）计算回收率。
回收率Recovery=最后一个时间点接受液中MCZ的累积量/产品强度×施加剂量 （3）
1.2.9.评估含有2%MCZ的霜之间的“相似性”/差异
比较IVRT研究按照FDA的SUPAC-SS指南进行。测试产品，即两种经批准和上市的仿制配方，Dermazole®霜（2%）和Covarex®霜（2%），与参考产品Daktarin®霜（2%）进行了比较。根据SUPAC-SS指南，将VDC随机分配给测试（T）和参考（R）产品。将从R和T释放的药物的单个累积量与时间的平方根作图。使用非参数统计方法Mann-Whitney U检验来计算R和T之间斜率比率的90%置信区间（CI）。由于IVRT实验期间预计会出现一些异常值（例如，由于气泡形成），因此使用了能消除该影响的Mann-Whitney U检验。
1.2.10.IVRT方法应用
使用两种不同浓度（0.5%和1%）的MCZ霜，通过用含水霜稀释Daktarin®霜（2%）来研究IVRT方法检测制剂差异的能力。将这些稀释产品与市售Daktarin®霜（2%）产品进行比较。
2、实验结果
2.1.HPLC 方法验证
HPLC方法的验证参数符合ICH指南规定的预定义验收标准，HPLC方法验证的结果见表4：
表4 HPLC方法验证结果
|
项目
|
结果
|
|
测试浓度范围
|
5、10、20、40、60、80和100µg/mL
|
|
线性
|
R2 ≥0.999
|
|
准确度
|
CV<5%@20、100和180µg/mL
|
|
重复性（n=3）
|
CV<5%@30、50、70µg/mL
|
|
重现性
|
实验间和实验内精密度-CV<5%
|
|
LOQ and LOD
|
1和0.33µg/mL
|
|
样品稳定性
|
台面（24±1°C） ，HPLC样品托盘（21°C）和冰箱（4±1°C） 为期9天
|
|
特异性
|
< 5%.特异性-安慰剂提取物没有显示任何干扰峰
|
机械性能验证
VDC的机械性能符合USP 1724中对于机械性能的要求。
2.2.性能确认测试 (PVT)
PVT实验符合预定义的验收标准，结果如表5所示。所得数据证实了IVRT系统的适用性和重现性。
表5 PVT数据
|
参数
|
验收标准
|
结果
|
|
实验内可变性
|
首次实验的CV（n=6 VDC）<15%
|
3.01%
|
|
第二次实验的CV（n=6 VDC）<15%
|
11.90%
|
|
实验间可变性
|
两次实验的CV（n=12 VDC）<15%
|
8.87%
|
|
产品相同性判断
|
90%置信区间必须在75–133.33%的范围内
|
下限：88.41%
上限：113.37%
|
2.3.硝酸咪康唑（MCZ）接收液研究
在对缓冲液的不同pH和摩尔浓度进行初步实验后，选择了50%乙醇和50%0.05M磷酸盐缓冲液（pH 4.5）作为IVRT的接收液，因为MCZ在该组合物中高度可溶。MCZ在接受液中的溶解度为3671 µg/mL（±60.24），比方法验证实验期间获得的样品中的最高测量浓度（150µg/mL）高10倍以上，确保满足漏槽条件。
2.4.滤膜筛选实验
尼龙、醋酸纤维素和Tuffryn膜的平均回收率分别为98.40%、95.10%和98.45%，表明其与MCZ结合可忽略不计。因此，膜不太可能作为MCZ的限速屏障。相反，Strat- M和纤维素酯膜显示出低的MCZ回收率，不符合±10%的可接受范围。
实验6小时后，使用尼龙和Tuffryn膜对Daktarin霜（2%）中MCZ的体外释放进行比较，结果显示释放率分别为86.64 µg/cm²/min½和76.68µg/cm²/min½。综合考虑释放率、可用性和经济性，选择了成本较低的尼龙膜作为滤膜。
2.5.IVRT方法验证
线性、精密度和重现性
当R2>0.9时，确认线性。根据SUPAC-SS指南，使用线性回归计算3次试验（n=6）的18个释放率。所有释放速率均显示单位面积释放到接收液中的药物量（µg/cm2）与时间平方根之间的线性关系（R2>0.99）。
变异性参数等于σ1=36.14，σ2=27.56，µ=57.86µg/cm²/min½，导致实验间变异性的变异系数为10.39%，实验内变异系数为9.07%。CV<15%证实了可接受的精密度和重现性。
灵敏度
平均释放率随MCZ浓度的增加而增加：对于含有1%、2%和4%MCZ的霜，平均释放率分别为14.56µg/cm²/min½（±4.84）、39.92µg/cm²/min½（±6.00）和73.55µg/cm2/min ½（±3.78）。则认为该方法是灵敏的，因为含有1%MCZ的霜产生的平均释放率显著低于含有2%MCZ的霜，而含有4%MCZ的霜产生的平均释药率最高。
特异性
观察到MCZ浓度与释放速率之间的线性关系（R2=0.9935）（图1）。因为测试产品的平均释放率与MCZ浓度成比例增加，证实了IVRT方法的特异性。
选择性
2%MCZ霜与1%和4%MCZ霜的配对比较，表明改方法能够准确识别“不同”的产品，而参考产品与自身的比较则证实了“相同性”的确定（表6）。（下表改为表7）
表6 MCZ乳膏的配对比较
|
配对比较
|
90%置信限-下限
|
90%置信限-上限
|
结论
|
|
MCZ乳膏1%vs MCZ乳膏2%
|
25.25
|
51.65
|
不同
|
|
MCZ乳膏4%vs MCZ乳膏2%
|
165.43
|
210.76
|
不同
|
|
Daktarin®乳膏（2%）（试验1）vs Daktarin®乳膏（2%）（试验2）
|
83.39
|
104.20
|
相同
|
|
Daktarin®乳膏（2%）（试验1）vs Daktarin®乳膏（2%）（试验3）
|
88.88
|
112.88
|
相同
|
|
Daktarin®乳膏（2%）（试验2）vs Daktarin®乳膏（2%）（试验3）
|
93.29
|
122.03
|
相同
|
耐用性
使用不同温度（即30°C和34°C）进行IVRT试验的平均释放率分别为55.14µg/cm²/min½（±8.15）和72.53µg/cm²/min½（±9.00）。平均释放率与在标称温度（32°C）下进行的IVRT试验（即59.30µg/cm²/min½（±7.27））得出的平均释放率之间的偏差没有超过15%，因此，证实了开发的IVRT方法对实验过程中温度微小波动的耐用性。
剂量消耗
为测试线性度、精密度和重现性而进行的IVRT试验中观察到的回收率分别为<30%，即27.11%（±2.00）、28.20%（±2.41）和29.75%（±3.26），这表明在既定的实验条件下不可能出现任何剂量耗尽，满足伪无限剂量要求。
2.6.评估含有2%MCZ的霜之间的“相似性”/差异
图2和表7分别显示了参考产品Daktarin霜（2%）与两种经批准和上市的仿制制剂Dermazole®霜（2%）和Covarex®霜的释放曲线和成对比较。
表7 参考产品与仿制制剂的配对比较
|
配对比较
|
90%置信限-下限
|
90%置信限-上限
|
结论
|
|
Daktarin® 乳膏 (2%) vs Dermazole® 乳膏 (2%)
|
93.93
|
103.74
|
相同
|
|
Daktarin® 乳膏 (2%) vs Covarex ® 乳膏 (2%)
|
61.93
|
72.98
|
不同
|
|
Dermazole® 乳膏 (2%) vs Covarex® 乳膏(2%)
|
68.26
|
74.50
|
不同
|
|
Daktarin® 乳膏 (2%) vs Daktarin® 乳膏 (2%)
|
97.10
|
113.39
|
相同
|
与参考产品Daktarin霜（2%）相比，Dermazole®霜的90%置信限（2%）落在SUPAC-SS验收标准（75–133.33%）的范围内，确认了两种霜之间的“相同性”，而与参考产品Daktarin软膏（2%）以及Dermazole®霜相比，Covarex®霜完全超出了可接受范围，表明这些霜不具有药物等效性。
局部剂型性能标准的差异，可以通过考虑Q1、Q2和Q3来解释，Q1、Q2和Q3分别指定性和定量数值以及剂型微观结构。使用Covarex®霜观察到的药物释放曲线的差异可能是由于赋形剂的差异（Q1/Q2）。Covarex®霜含有咪唑烷基脲（0.2%）、尼泊金甲酯（0.15%）和尼泊金丙酯钠（0.15%），而Daktarin®和Dermazole®霜含有苯甲酸（0.2%）。辅料的这些差异可能会改变药物制剂的物理化学性质、皮肤渗透性、溶解度和热力学活性以及制剂的Q3属性。
由于制备方法的不同，检测配方差异的研究结果如图3所示
Daktarin®霜中MCZ的释放率（2%）明显高于1%和0.5%MCZ霜（图3）。这可能是由于Q3的差异，即与物质的微观结构和排列的差异，以及Q1/Q2的差异有关，图3所示的释放曲线表明，IVRT系统可以区分使用不同规格，不同制剂工艺的制剂。
3、结论
根据美国食品和药物管理局阿昔洛韦软膏和霜指南草案、SUPAC -SS非无菌半固体剂型指南和USP通用章节的建议，对已批准和上市的外用MCZ霜进行体外评价。一种仿制霜Dermazole®霜（2%）与参考产品Daktarin®霜（2%）表现出“相同”，而另一种仿制软膏Covarex®霜（%），其MCZ释放率不在75–133.33%的接受标准范围内，则认为不具有体外等效性。两种仿制霜之间的比较，表明它们在体外并不等同。
总之，开发良好的IVRT方法，能够准确区分不同规格产品的体外释放率，这可以反映产品性能的相似性和/或差异。此外，结果表明，IVRT方法还具有检测配方变化的能力，这可能是由于Q1/Q2/Q3不同所造成的。经验证的IVRT系统提供了证据，方法能够准确评估仿制的配方外用霜产品中MCZ的释放。结果证实了IVRT方法适用于以可靠和可重复的方式，测量局部皮肤霜中MCZ的释放率，并为将来使用此类产品获得生物豁免，提供了令人信服的数据。
参考原文：《Assessment of “Sameness” and/or Differences between Marketed Creams Containing Miconazole Nitrate Using a Discriminatory in vitro Release Testing (IVRT) Method》
