杂质研究与控制作为药品质量可控性的重要衡量指标之一，在药物研究中占有举足轻重的地位。杂质研究的基础是工艺设计，其根本在于药物中杂质谱的分析，杂质控制在于通过专属，灵敏和准确的方法对杂质进行限度或限量的检测与控制，而杂质控制中的关键是方法的合理选择与验证。目前，杂质控制如有关物质多采用HPLC的方法，那么在开发杂质控制的HPLC方法中色谱条件的选择即为首要任务，如何能高效的开发出专属性强，灵敏度和准确度高的色谱方法呢，本文从“k、α、n”谈谈杂质控制中色谱条件的选择，希望可以给广大同行以参考。
色谱条件选择首要目标是明确色谱条件中的参数及可接受标准，包括色谱柱、流动相及洗脱方式、检测波长、柱温、流速和进样体积，那么色谱条件的选择也就是以上参数的开发与拟定的过程。那么，在以上参数均为可变量时，哪些是相对影响程度低的可先固定不变呢，依经验分析可先固定进样体积、流速和柱温为常用参数，比如进样体积10μl或20μl，流速1.0ml/min（如常规的4.6mm内径和5μm或3.5μm的粒径色谱柱），柱温30℃或5℃。检测波长可根据200-400nm的全波长扫描结果拟定或者根据可参考的标准进行拟定。那么，首先需要变化的就是色谱柱和流动相及洗脱方式。在讨论过参数之后，可接受标准更是关键，以有关物质的方法为例，如，主成分S、其特定杂质S-1、S-2，需开发S的有关物质HPLC方法，那么在选择色谱条件的时候，首要的是专属性，而专属性中的重要衡量指标就是分离度，即拟定的方法的系统适用性要求中，杂质S-1、S-2与主峰之间的分离度需满足要求，两个杂质之间的分离度需满足要求。这里面划重点的内容就是分离度，分离度的计算公式如下，从公式可以看出其影响因素分别为k、α、n。
首先，谈谈α对色谱条件选择的影响，α（选择性）的主要影响因素体现为色谱柱，根据化合物的结构特点选择不同的色谱柱型号，如目标物S为含多个-OH及-COOH结构的化合物，势必C18柱无法实现有关物质的方法开发，因为其主成分的tR时间极可能为2min左右的溶剂出峰位置出峰，也就是随着t0就被洗脱了，那么就可以考虑改用C8或者-NH2柱进行分析。在根据待分析物的结构特征拟定了色谱柱的型号之后，不同的厂家的选用的硅胶处理技术不同，还会给选择性带来很显著的差异，如在开发化合物S的异构体方法过程中，选用色谱柱1时，无论流动相的比例如何调整，特定杂质S-1始终与异构体杂质重合，但是当选用色谱柱2后，特定杂质不再干扰异构体杂质的测定，如图1所示（BM-A），可见，色谱柱是α的关键风险因素，在优化分离度过程中，特别是组分的k值很大，且有重叠时，改变α是关键。
其次，谈谈k对色谱条件选择的影响，k（保留值）的影响因素相对较多，比如色谱柱，流动相，柱温，流速等均会对保留值带来影响，那么如何协调几个因素，在较短的时间内找到合适的色谱条件呢，通常先选定色谱柱，柱温和流速可以预先设定值进行固定，然后拟定流动相，如有机相选择单相的甲醇或乙腈，或者多相结合，水相选择水，酸性水如磷酸水、三氟乙酸水或者醋酸水等，或者缓冲盐，或者碱性水如三乙胺水等。流动相的种类确定之后就是洗脱方式的选择对待分析的有关物质进行分析了。如有关物质的方法开发时，有关物质包括中间体、副产物和降解产物等，各化合物的极性差别较大，多采用梯度洗脱的方法同时分析几个杂质，此时变化梯度的速率就是影响k值的一个表现，如图2所示。另外，在梯度变化对k值的影响较小时，可以通过改变pH值调节各化合物的k值而实现分离，如图3所示。此外，有时候仅仅是变化柱温和流速也可以使k值发生变化，达到有效的分离目的，如图4和图5所示。
最后，谈谈n对色谱条件选择的影响，柱效在色谱条件中同样发挥着重要的作用，在方法开发的过程中时而出现拟定的色谱条件无法达到系统适用性中的分离度的要求了，可能我们会怀疑自己的流动相比例是不是设置错了，那个参数不对了，自己配制的流动相是不是出现了偏差，此时，出现偏差的可能就是色谱柱了，某些化合物的分离对柱子的柱效要求比较高，当柱效降低之后就会发生分离度不能满足要求的情况发生。那么在方法开发过程中柱效是不是也同样重要，答案是肯定的，在两个极性极为接近的化合物的分离中，因为k值接近，无论变化哪些参数，均无能为力的时候，可以考虑选择柱效更高的色谱柱，那么如何提高色谱柱的柱效呢，可以通过更小内径和粒径的色谱填料实现，但是同样需要兼顾选用的液相的耐受的最高压力，避免方法无法实施。如图6所示，即为选用更高柱效的色谱柱后，实现了某个未知杂质间的有效分离。在k值接近的时候，选择改变n也是行之有效的方法。
综上所述，杂质控制方法中色谱条件的开发第一步是解决待分析物中的分离度问题，分离度的三个影响因素k、α、n在色谱条件的选择中发挥着不同的作用，在方法开发的进程中能够巧妙的运动几个因素的发挥作用的阈值点，往往可以起到事半功倍的效果，能够在最短的时间完成最佳的色谱条件的选择与拟定，既节省了时间成本又节省了经济成本。
参考文献：
实用高效液相色谱法的建立。
