反相高效液相色谱是当今液相色谱的最主要的分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物的分离，尤其是在药物分析方面，它是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，正好与由极性固定相和弱极性流动相所组成的液相色谱体系（正相色谱）相反。典型的固定相是十八烷基键合硅胶，典型的流动相是甲醇和乙腈。下面就来讲讲方法开发的那些事。
色谱分离理论
1、溶剂的选择
液相色谱顾名思义要使用液体作为载体，这些液体就是我们常用的溶剂，常见的溶剂有以下几种，极性由弱到强。在液相色谱分析中有一个最基本的要求就是化合物必须能溶于所使用的溶剂，所以在开发方法之前，我们要根据现有化合物的一些官能团，来查看或者推测它的溶解性，来找到能够溶解目标化合物的溶剂。
2、分离模式
了解了化合物的溶解性，还可以确定分析它使用何种分类模式，下面是一些常见化合物的所对应的不同的分离模式。
从整个图表上看，反相色谱占了很大的一个比重，世界上70%到80%的化合物都可以利用液相色谱进行分离，而在这70%到80%的化合物当中又有70%到80%的化合物是可以用反相色谱进行分离，所以，反相色谱一直是色谱分离模式中讨论的焦点。除了化合物的溶解性，我们可以根据化合物的分子量去选择合适的分离模式，可也根据下表选择具体的分离模式。
3、方法开发的目标和评价
在方法开发或者建立方法之前，会确定一个目标，对于液相色谱的方法来说，第一步，分离；第二步，分析时间；第三步，方法的耐用性。
对于分析方法的评价可以从分离、峰型、效率、重现性、耐用性和经济性6个方面进行评价。
4、方法开发中的组成要素
色谱条件中涉及的基本参数：固定相（种类、规格）、流动相（种类、比例、模式）和仪器参数（分离模块、检测模块）。
5、分离度的三个影响因素
选择性对分离影响最大，但难以预测；保留达到一定程度后几乎不再对分离度有贡献；柱效对于分离度有持续的增长作用，但效果受限制。
6、方法开发的步骤
甲醇/乙腈的选择
反向色谱最常用的甲醇或乙腈，甲醇的截至波长为205nm，乙腈的截至波长为190nm，乙腈水系统由于其粘度非常低，塔板数较高而柱压较低，是流动相的最佳选择。通常40%的乙腈具有与50%的甲醇相似的溶剂强度。
基于溶剂不同的选择性，甲醇为类质子溶剂，可形成氢键，对于分离酸碱或电负性强的化合物有提高选择性，乙腈为极性分子，其碳氮三键含有未成键电子，能与含有空轨道的化合物结合，则与甲醇有着不同的化合物选择性。有时单用ACN或MEOH可能会达不到理想的分离效果，在流动相同时使用ACN和MEOH可改变选择性以获得较好的分离效果。简言之，在改变分离选择性的时候，甲醇细调，乙腈粗调。主要是为了调整流动相的粘度和强度，使得分离效果和选择性有所改善。
离子对的选择
1、适用范围
使用液相色谱法分析电离能力比较强的样品时，样品在反相色谱柱上的保留时间很短或者根本不保留，这时要加入相应的离子对试剂，将分析物上的离子进行结合，形成在柱子上有保留的分子。
2、作用原理
加入离子对试剂后，它可以与待分析的物质（多为在溶液状态时显以与离子对试剂相反的电荷）结合成离子对而呈中性，疏水性增加而在色谱柱上有保留行为。离子对类似于胶黏剂，一头以离子吸引住待测物（也是离子），另一头以碳链与固定性作用，从而把待测物保持在固定相上。
3、试剂选择
离子对分为正离子对和负离子对，分析酸性样品（确切的说应该是作用基团）用正离子对试剂，分析碱性样品用负离子对试剂。正离子对试剂可以吸附带负电荷的样品组分，负离子对试剂反之。戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠.....十二烷基磺酸钠属于负离子对试剂；四丁基溴化铵、四丁基硫酸氢铵、四丁基氢氧化铵等属于正离子对试剂。离子对要考虑样品体系的复杂性和干扰物的特性，先用碳链短的，浓度尽量低，降低对色谱柱填料的影响，同时流动相的pH值尽可能低以确保离子化程度。
4、离子对试剂的浓度
通过改变被固定相吸附的离子对试剂的多少，有可能将保留过程由反相改变为离子交换色谱。这种改变是通过改变流动相中的试剂的浓度实现的。同常浓度范围从几毫摩到几十毫摩不等。
注意事项：三乙胺、醋酸铵也起到部分离子对试剂的作用，使用离子对的色谱柱建议专柱专用。
等度与梯度的选择
1、梯度洗脱用于方法建立，对于组分未知的样品进行HPLC方法建立时，即使最终分离拟用等度洗脱仍需先采用梯度洗脱进行方法开发。
2、初始梯度洗脱分离可以近似估计出样品的保留值范围，为后续试验选择等度或梯度提供必要的依据。
3、若等度洗脱是最好选择，初始梯度试验可为进一步试验提供最佳%B的估算值。
4、初始梯度洗脱实验可以使整体样品分离更好、更快。
5、初始梯度洗脱遗漏早与晚流出的低浓度组分的可能性较小。
6、初始梯度通常为线性梯度（全梯度），如5—100%B，根据杂质情况，1.5梯度/min或5梯度/min，进行试验。
7、梯度洗脱时由于改性剂在水相的吸收与有机相中的吸收不同，导致基线漂移，可通过混合流动相的方式进行改善。
8、通常含量常采用等度方法，有关检测建议采用梯度的方法，在进行含量方法确定时，需评估潜在杂质对主峰的影响及方法的运行时间。
