摘 要 / Abstract
近年来，疫苗领域迎来了快速发展期，同时也面临着最严格的监管。与一般药品不同，疫苗主要用于预防，面向健康人群，婴幼儿是重要的接种人群，其质量直接关系着公众的生命安全。疫苗的研发及质量评价工作极具挑战性，为此，对其相应的分析技术也提出了更高的要求。质谱技术是目前最为重要的分析技术之一，其既可提供分子质量和结构等方面的信息，也可采用内标法或外标法对目标化合物进行定量分析，广泛应用于生物制品的早期发现、研发及生产等环节。本文结合多篇已发表的文献或技术文章，详细概述了液相色谱- 质谱联用技术在疫苗分析中的应用，包括重组蛋白疫苗、病毒疫苗、多糖蛋白结合疫苗、核酸疫苗及辅料和佐剂的质量控制，以期为新型疫苗的研发和质量控制提供有效的分析方法。
In recent years, the vaccine industry has experienced the most rapid development in the history, and is faced with the most stringent regulatory oversight. Unlike ordinary drugs, vaccines are mainly used for prevention and are targeted at healthy individuals, most of whom are infants. Therefore, the quality of vaccines has a direct bearing on public safety and wellbeing. The development and quality evaluation of vaccines pose significant challenges, requiring corresponding analytical techniques. Mass spectrometry is one of the most important analytical techniques at present, which can not only provide information on molecular mass and structure, but also enables quantitative analysis of target compounds using internal or external standard methods. It has been widely used in early discovery, development, and production of biological drugs. To provide effective analytical methods for the development and quality control of new vaccines, this paper comprehensively reviews a few published literature or technical papers to summarize the application of liquid chromatography-mass spectrometry in vaccine development, mainly involving the quality control of recombinant protein vaccines, viral vaccines, protein-polysaccharide conjugate vaccines, nucleic acid vaccines, excipients, and adjuvants.
关 键 词 / Key words
液相色谱- 质谱联用技术；重组蛋白疫苗；病毒疫苗；多糖蛋白结合疫苗；核酸疫苗
liquid chromatography-mass spectrometry; recombinant protein vaccine; viral vaccine; protein-polysaccharide conjugate vaccine; nucleic acid vaccine
疫苗是人类抵御疾病的重要武器，是成本最低、效果最好的疾病防御手段。近年来，疫苗领域迎来了快速发展期[1-2]，同时也面临着最严格的监管。2019 年12 月1 日，《疫苗管理法》正式实施，首次将疫苗管理上升到法律层面。对疫苗的生产和质量进行监控是疫苗监管中尤为重要的一部分。疫苗研发涉及的技术路线多样，包括灭活病毒疫苗、重组蛋白疫苗、mRNA 疫苗等，其质量评价工作极富挑战性，例如多种微量的免疫原组分、复杂的佐剂等对其相应的分析技术提出了较高的要求。质谱（mass spectrometry，MS）分析是20世纪发展起来的重要分析技术之一，其具有分析对象范围广、样品用量少、分析速度快、灵敏度和分辨率高等特点，目前已广泛应用于生命科学领域和药物的早期发现、研发及生产等环节。质谱分析既可提供分子质量和结构等方面的信息，也可采用内标法或外标法对目标化合物进行定量分析，为疫苗相关研究工作提供了新的研究思路与技术方法。
本文结合多篇已发表的权威文献或技术文章，对疫苗分析过程中所使用的液相色谱- 质谱联用技术进行了详细的概述，主要包括重组蛋白疫苗、病毒疫苗、多糖蛋白结合疫苗、核酸疫苗及辅料和佐剂等，以期为新型疫苗的研发和质量控制提供有效的分析方法。
1、质谱分析技术概述
质谱分析技术的基本原理：样品由进样系统导入离子源，在离子源中电离生成带电荷的正离子（或负离子），然后在真空状态和加速电场的作用下形成离子束进入质量分析器，通过质量分析器分离和过滤，不同质荷比的离子经检测系统转换为可测量的信号， 从而得到质谱图。在日常分析中， 单组分及有一定挥发性的固体或高沸点的液体样品通常可以采用直接进样的方式进入质谱仪中进行分析。但大多数测定样品为复杂的多组分，在进入质谱仪前需预先进行分离，由此衍生出分离与质谱联用的技术，包括液相色谱- 质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技术、气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry ， GC-MS）技术、毛细管电泳- 质谱联用（capillary electrophoresis-mass spectrometry，CE-MS）技术等。
电离是质谱分析中必不可少的步骤之一，样品的电离效率很大程度上决定了最终的检测信号强度。离子源具有多种类型，实际应用中可结合样品的性质和目标分析物的理化特性进行选择。常见的离子源包括：电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI）、电子电离源（electron ionization, EI）、化学电离源（chemical ionization，CI）、电感耦合等离子体（inductively coupled plasma,ICP）、基质辅助激光解析电离源（matrix-assisted laser desorptionion ization,MALDI）等，其中应用最为广泛的是ESI。对于质量分析器，不同厂家的质谱仪存在一定的差异，常见的质量分析器包括飞行时间（time of flight，TOF）分析器、四极杆（quadrupole，Q）分析器、离子阱（ion trap，IT）分析器、静电场轨道阱（orbitrap）分析器和傅立叶变换离子回旋共振（fourier transform ion cyclotron resonance，FT-ICR）分析器。除此之外，还包含多种串联质谱分析器：三重四极杆（QQQ）、四极杆飞行时间（Q-TOF）、四极杆离子阱（QIT）、离子阱飞行时间（IT-TOF）等。对于检测器，常见的检测器包括电子倍增检测器、法拉第杯检测器、光电倍增检测器、阵列检测器等。近年来，质谱分析技术发展迅猛，不断涌现出新颖的电离技术、质量分析技术，例如增加离子淌度的4D 质谱技术以及交联质谱、氢氘交换质谱、基质辅助激光解析或电离质谱成像等多维联用技术，进一步拓展了质谱技术的性能和应用领域。
2、LC-MS 技术在疫苗分析中的应用
2.1 重组蛋白疫苗
重组蛋白疫苗主要借助体外制备的病原体特异蛋白，刺激人体产生抗体，起到预防疾病的目的。其主要生产工艺原理：先明确病原体具有免疫原性的特异蛋白，再通过基因工程技术，将病原体特异蛋白基因整合到合适的表达系统（例如酵母菌、大肠杆菌等微生物），最后通过体外大量培养表达病原体特异蛋白，再经纯化，制备成疫苗。其优点主要是易于贮存和运输、使用方便、制备简单、容易大量生产、成本低、免疫时间长等。为了确保进入临床研究疫苗的安全性、有效性和稳定性，必须采用适当的方法对重组蛋白疫苗样品进行严格的表征和质量控制。
目前，LC-MS 技术是重组蛋白疫苗在发现、开发、生产及上市审批检测中结构表征、质量标准制定、质量控制评价改进中的重要支撑技术，可用于分析与评价重组蛋白疫苗产品的质量，保障产品的安全性。《中国药典》（2020 年版）三部规定了人用重组单克隆抗体制品的制造要求，指出抗体特性分析至少包括结构完整性、氨基酸序列、二级结构等[3]。实际生产研发过程中，重组蛋白疫苗的生产工艺和质量控制可参考重组蛋白药物的相关指导原则。目前，LC-MS 技术已被应用于包括重组蛋白疫苗的分子量分析、亚基分子量分析、肽图分析（包含序列覆盖度分析、翻译后修饰分析、二硫键分析）、目标蛋白定量分析等多个方面。此外，LC-MS 技术还被广泛应用于重组蛋白疫苗的工艺相关杂质的分析，例如宿主细胞蛋白残留分析。
2.1.1 分子量分析
作为蛋白样品的主要特征参数之一，蛋白分子量分析已成为蛋白类生物制品表征的重要环节之一，是确定一种新型蛋白、进行后续研究活动的重要前提。对于重组蛋白疫苗的分子量分析，常采用以有机溶剂为流动相的反相液相色谱（reversed-phase liquid chromatography，RPLC）与高分辨质谱联用进行蛋白的变性质谱（denatured MS） 分析， 在该模式下蛋白的电荷数据较多， 更容易分析。除变性质谱之外，非变性质谱（native MS）分析也经常用于重组蛋白疫苗的分子量分析，该模式下主要采用尺寸排阻色谱法（size-exclusion chromatography，SEC） 或疏水相互作用色谱法（hydrophobic interaction chromatography，HIC） 等进行分离，使用可挥发性盐作为流动相。与变性质谱相比，在非变性质谱分析中，蛋白通常所带电荷较少，需要较高的进样量才能够获得较高的响应。此外，非变性质谱分析通常不需要对样品进行前处理，最大程度上保持蛋白的天然结构，与变性质谱技术互为补充，能够比较全面地表征蛋白的结构信息，例如蛋白分子构象、蛋白多聚体等分析。对于结构较为复杂的蛋白样品，有时为了降低蛋白本身的复杂性，会使用木瓜蛋白酶等蛋白水解酶，将蛋白切割成分子量为25~50kDa的亚基片段， 从而更易于质谱的结构分析。此外， 对于部分糖基化位点较多的糖蛋白， 还会采用肽-N-糖苷酶 F 去掉N-糖，进一步降低蛋白的复杂性。
2.1.2 肽图分析
肽图分析是重组蛋白表征的重要检查项目之一，其通过酶解（一般使用胰蛋白酶）将蛋白酶解成肽段，然后以可重现的方式进行肽段的分离和鉴定。肽图分析是一种非常有用的技术，能够提供待测蛋白的全面信息，已成为生物制品分析领域中重要的工具之一。肽图分析不仅能检测和监控单个氨基酸改变、氧化、去酰胺化以及其他降解形式，还可用于N 端环化、C 端赖氨酸处理、N-糖基化，以及内含子表达等非预期的变异分析。在实际的研发与生产过程中，重组蛋白疫苗将会参考重组蛋白药物的肽图分析技术，利用反相液相色谱或质谱进行酶解肽段混合物的分离检测。目前，该技术已经成为鉴定重组蛋白疫苗的首选方法和产品出厂的必行检测。
2.1.2.1 序列覆盖度分析
蛋白序列覆盖度的检测是对蛋白类生物制品一级氨基酸序列的确证， 目前主要分析方法包括Edman 降解法和质谱法。Edman 降解法最多可以测定N 端的50~70 个氨基酸，因此长度较短的多肽药物可以通过Edman 降解法进行测序，但是对于蛋白类生物制品来说，Edman 降解法一般不适用于进行蛋白全序列检测。LC-MS 技术是进行蛋白氨基酸序列覆盖度分析的重要手段，是蛋白类生物制品表征的重要方法。在重组蛋白疫苗申报时，需采用质谱法进行蛋白序列覆盖度的检测。新冠病毒（SARS-CoV-2） 有4 种主要的结构蛋白：刺突蛋白（spike protein，S 蛋白），核衣壳蛋白（nucleocapsid，N 蛋白），膜蛋白（membrane protein，M 蛋白），包膜蛋白（envelope protein，E 蛋白）。其中，S 蛋白是病毒最重要的表面膜蛋白，也是引起免疫应答的重要抗原，是疫苗设计的关键靶点。作为一种非常重要的技术路线，新冠病毒重组蛋白疫苗就是以基因工程方法，大量生产新冠病毒最有可能作为抗原的S 蛋白， 刺激人体产生抗体，达到预防疾病的效果，因此，其结构表征和质量控制对药物安全性十分重要。Liu等[4] 采用ZenoTOF 7600 结合Biologics Explorer 软件对新冠病毒的S 蛋白进行表征分析，得到了95% 以上的序列覆盖度并找到了N501Y 突变。相比于碰撞诱导解离（collision-induced dissociation，CID）碎裂模式，电子活化解离（electron activation dissociation，EAD） 谱图中可以提供更为丰富的碎片离子信息，从而保证获得较好的序列覆盖度，如图1 所示。
2.1.2.2 翻译后修饰分析
LC-MS 技术不仅可以获得蛋白的氨基酸序列初级结构信息，还可用于翻译后修饰（post-translational modification，PTM）的分析。糖基化是重组蛋白疫苗最主要的翻译后修饰之一，常见的糖基化修饰主要包括糖链与天冬酰胺残基连接的N-糖基化以及糖链与丝氨酸或苏氨酸残基连接的O-糖基化。糖基化对重组蛋白疫苗等生物制品的稳定性、构象、免疫活性等有着重要影响。很多重组蛋白疫苗都是高糖基化蛋白，糖基化分析对于产品的表征分析具有重要意义。对于蛋白的糖基化分析可以从多水平进行，包括完整糖蛋白水平、糖基水平和糖肽水平。完整糖蛋白水平的分析虽然具有样品消耗量少、前处理简单（不需化学或酶解处理）等优点，但是其对质谱仪器和解析软件提出了较高的要求。糖基水平的分析为重组蛋白疫苗样品的糖基化分析提供了详细的信息，除了可以识别蛋白上存在的特定糖型外，还可以获得其准确的结构信息，但无法获得糖基化位点的信息。相比而言，对酶切后的样品进行糖肽水平的分析，能够获得糖基和糖基化位点间的对应关系的信息，对于重组蛋白疫苗的糖基化分析具有重要作用。对于糖肽的分析，CID 技术往往会使糖肽中糖基部分优先碎裂，产生较多的氧鎓离子；相反，其氨基酸部分较难碎裂，从而导致该糖肽的二级碎片覆盖度低，不能有效获取糖肽的完整骨架信息，无法准确确认肽段序列和糖基化位点的信息。特别是对于糖基化非常复杂的糖蛋白疫苗， 利用该技术获得准确和全面的信息具有一定的挑战性。EAD 作为一种新型离子碎裂技术可以有效解决该问题，其能够有效断裂糖肽的氨基酸部分和保持糖基的完整性，准确地定位糖基化位点并获得丰富的二级质谱（MS/MS） 信息。Mahan等[5] 利用ZenoTOF 7600 系统对通用流感疫苗（universal fluvaccine） 的糖肽进行了鉴定，并确认了糖基化位点，分析了糖基相对含量，如图2 所示。利用ZenoTOF 7600 特有的Zeno离子阱信号增强功能与EAD 技术相结合， 可以获得高质量的MS/MS 质谱图，能够准确鉴定出低丰度的糖型[5]。
除糖基化外，目前已经发现的对蛋白类生物制品质量产生影响的潜在翻译后修饰还有谷氨酸环化、甲硫氨酸氧化、天冬酰胺（Asn）去酰胺化、C 端赖氨酸丢失等。其中，天冬酰胺去酰胺化形成的天冬氨酸（Asp，D） 和异天冬氨酸（isoAsp，isoD）因其结构不同，会影响蛋白最终形成的高级结构，进而影响蛋白功能，因此在重组蛋白疫苗表征过程中需对D 和isoD 进行严格区分。然而，D 和isoD 的区分一直是蛋白表征的难点，在CID 的碎裂模式下，D 和isoD 具有相同的二级碎片，无法实现有效区分。而在EAD 的碎裂模式下，isoD可以形成独特的诊断离子z-57和c+57，从而可以有效区分D 和isoD。Liu 等[4] 采用ZenoTOF7600 成功区分出了新冠病毒中S 蛋白的D 与isoD， 通过诊断z8-57 离子的发现可以准确确定该肽段上2 个isoD 异构体的存在，如图3B 和图3D 所示；而该诊断离子的缺失可以确定该肽段上为天冬氨酸，如图3C 所示[4]。
2.1.2.3 二硫键分析
二硫键对于稳定蛋白药物的空间结构，保持其活性具有重要的作用。分子内二硫键的连接是重组蛋白疫苗的关键质量属性之一，二硫键的错配可能会导致蛋白的错误折叠使蛋白更倾向于聚集并可能产生一些不确定的免疫反应，是重组蛋白疫苗的质量和安全评价中不可或缺的部分。在二硫键的质谱分析中，CID 与EAD是常用的二级碎裂方法。在CID中，二硫键阻止半胱氨酸（Cys）残基周围的肽链碎裂，二级谱图质量较差，从而限制了二硫键信息的准确判定。而EAD 可以通过调整电子能量来改变断裂机制，不会受到二硫键的影响，能够获得更为全面的二级信息，特别适合于蛋白样品的二硫键分析。如图4 所示，EAD 的谱图碎片离子相较CID 更加丰富，可对二硫键进行更加准确的判定。
2.1.3 宿主细胞蛋白残留分析
除重组蛋白疫苗自身外，工艺相关杂质之一的宿主细胞蛋白（host cell protein, HCP）也是检测蛋白疫苗质量和安全评价的重要项目之一。酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunesorbent assay，ELISA） 是目前HCP 检测的主要方法，但其无法检测一些弱免疫原性或非免疫原性的HCP，且无法对单个HCP 进行鉴定。但LC-MS 技术可以实现痕量HCP的鉴定和定量，是ELISA 技术较好的补充。其常用的策略是首先通过在线二维高pH 或低pH 反相色谱分离多肽，解决HCP 杂质分析时样品复杂以及动态范围较宽的问题，提高HCP 检测灵敏度；然后再基于质谱技术同时表征疫苗蛋白与HCP 杂质。质谱中常用的数据采集模式为数据依赖性采集，该种模式下，只有满足一定判定条件的肽段才能够发生二级碎裂，获得响应的二级碎片信息，而对于一些不满足判定条件的肽段，则不容易被检测到，HCP 分析偶尔会出现遗漏，容易出现假阴性。数据非依赖性采集（如SWATH®）是一种全景式的扫描方式，能够全面获得每一条肽段的二级碎片信息，保证HCP 的准确鉴定和定量。Chen等[7] 利用ZenoTOF 7600 系统采用SWATH® 方式，加上其自带的Zeno 离子阱富集功能，对HCP 进行全面可靠的鉴定及超灵敏的定量，可达到亚ppm 水平，有效避免假阴性情况的出现，如图5 所示，借助该方法可以有效应用于不同纯化阶段的样品中HCP 杂质的残留检测，包括成品药物、病毒过滤后样品、阳离子交换后样品和蛋白亲和色谱后样品。
2.1.4 目标蛋白定量分析
疫苗中抗原蛋白的含量与疫苗的有效性直接相关，在提升疫苗质量、加强疫苗质量评价力度的呼声中，测定疫苗成品中抗原蛋白含量的需求日益迫切。对于新冠病毒疫苗来说，传统方法检测新冠病毒S 蛋白含量需要依靠免疫学分析方法，例如ELISA 技术。利用ELISA 技术检测S 蛋白需要大量时间通过动物免疫过程制备特异性抗体，且对抗体质量要求较高，不仅需要极高的特异性，而且抗体一般需要较高的亲和力。ELISA 技术在检测过程中易受检测样本中其他成分干扰影响测定结果，造成定量不准确。ELISA 技术操作过程复杂，需要进行3~5 步骤孵育和酶联反应板洗涤操作，人为因素对实验影响较大，而且去反应过程易受环境因素影响，故其稳定性和重复性较差。近年来，LC-MS 技术在蛋白的检测分析方面具有高选择性和高灵敏度等优点，非常适用于复杂生物基质中靶向蛋白的定性和定量研究。Lane 等[8] 建立了一种靶向多肽定量测定法，用于检测新冠病毒的两种病毒蛋白：S 蛋白（SPIKE_SARS2）和N蛋白（NCAP_SARS2）。研究人员首先通过基因重组技术合成了这两种病毒蛋白，通过特异性肽段的查找，质谱参数的优化，确定了最佳的多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）条件；然后将合成的重组蛋白样品添加到健康患者的鼻咽拭子样本中，确定了该方法的检出限。该方法稳定性好，重复性好，检出限可达fmol 级别。
2.2 病毒疫苗
病毒疫苗包括减毒活疫苗和灭活疫苗， 通常由核酸及外面包裹的衣壳蛋白组成， 体积较大。对于病毒疫苗，在其结构表征和质量控制方面， 也参考了重组蛋白疫苗的相关方法， 其中LC-MS 技术发挥了积极推动作用。Zhang 等[9] 采用LCQ-TOF-MS 法分析了流感疫苗裂解液中的血细胞凝集素（hemagglutinin，HA）与核蛋白（nuclear protein，NP） 的完整分子量，如图6 所示。研究人员通过一级质谱法鉴定出分子量分别为25 156.3、34 779.6、36315.6 和55 440.3 的4 种蛋白，后根据流感病毒蛋白的理论分子量，推断其分别为HA2 去糖基化蛋白、HA1 去糖基化蛋白、肽-N-糖苷酶 F 和核蛋白。此外，还分析了流感疫苗裂解液中的血细胞凝聚素与核蛋白的序列覆盖度，检测结果均约为80%。
2.3 多糖蛋白结合疫苗
多糖蛋白结合疫苗是一类以细菌多糖与蛋白通过化学反应偶联形成的疫苗，可以克服传统多糖疫苗对婴幼儿免疫效果较差的缺点。多糖蛋白结合疫苗的研发及成功上市是预防细菌性传染病的突破，目前已批准上市的多糖蛋白结合疫苗主要有b 型流感嗜血杆菌结合疫苗、13 价肺炎球菌多糖结合疫苗和A 群C 群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。多糖蛋白结合疫苗生产工艺及过程控制相比于其他细菌性疫苗更为复杂，需要对其工艺过程有充分的认识，把握其工艺过程的关键操作步骤、关键操作参数、关键控制项目及控制指标，才能在多糖蛋白结合疫苗生产过程中，避免减少次要偏差的发生，杜绝重大偏差的发生，确保多糖蛋白结合疫苗质量安全有效。质谱技术是多糖蛋白结合疫苗强有力的表征技术，Wang 等[10] 利用ZenoTOF 7600对多糖蛋白结合疫苗生产过程中使用的载体蛋白CRM197 进行了分子量和序列覆盖度的有效分析，其结果准确度高，序列覆盖度可达95% 以上。
2.4 核酸疫苗
mRNA 疫苗是将含有编码抗原蛋白的mRNA 导入人体，直接进行翻译， 形成相应的抗原蛋白， 从而诱导机体产生特异性免疫应答，达到预防疾病的目的[11]。相比于传统疫苗，mRNA疫苗在安全性、有效性、开发速度和规模化生产能力等方面具有显著优势。然而，mRNA 性质不稳定，极易被无处不在的核酸酶降解，使得mRNA 疫苗在生产、工艺、长期储存等过程存在挑战。同时，mRNA 分子量较大（300~5000kDa）， 若要顺利进入细胞质中发挥作用，必须依靠递送系统，而递送系统很大程度决定了mRNA 疫苗的安全性、储藏条件和储藏时限。因此，需要在mRNA 疫苗生产的各个阶段进行质量评估及控制。
2.4.1 mRNA 加帽效率分析
mRNA 作为疫苗，通常以线性化的DNA 作为模板，通过体外转录（in vitro transcription，IVT）获得。真核生物mRNA 的5'端有一个由三磷酸桥接的7-甲基鸟苷（m7G）帽，这种结构被称为Cap 0。Cap 0 在翻译起始因子的招募过程中起着非常重要的作用，而且在细胞质中还可以防止mRNA 被降解。在高等真核生物中，第一个近端核苷酸的核糖2 号碳羟基甲基化形成Cap 1结构（m7GpppmN），其中约有50%mRNA 的近端第二个核苷酸的核糖2 号碳羟基甲基化可形成Cap2 结构（m7GpppmNmN），因此加帽效率成为mRNA 疫苗生产过程中重要的质量参数之一。作为疫苗使用的mRNA 长度通常为几千个核苷酸（nt），而5'端的帽子结构的分子量为297Da，接近一个核苷酸的分子量，几千个核苷酸长度下无法区分单个核苷酸的差异，需要酶切为短片段才可以通过质谱技术进行分离和检测。Beverly 等[12] 提出了核糖核酸酶H（ RNase H）介导的探针切割法， 该方法使用一段2'-O-methyl 修饰的生物素标记RNA 探针，可与底物mRNA5'UTR 区域发生互补配对， 而RNase H 会切割与探针3'末端切割位点配对的mRNA 序列。之后，利用链霉亲和素磁珠分离得到5'切割产物，再通过LC-MS技术定量分析帽子结构，计算出加帽效率。Song 等[13] 利用特定的核糖核酸酶（RNase） 将mRNA 加帽端切割为15~30nt的片段，再利用质谱技术对酶切后的片段进行检测，有效地分离出未加帽与加帽的mRNA 片段，如图7 所示，然后根据加帽片段峰面积占未加帽与加帽片段峰面积之和的比例计算出mRNA 的加帽效率。
2.4.2 mRNA 尾巴分布分析
多聚腺苷酸（Poly A）尾巴有助于维持mRNA 的稳定性、运输和转译效率，影响着mRNA 的半衰期。根据mRNA 种类的差异，通常Poly A 尾巴的长度在几十至几百个核苷酸之间。mRNA 的3'端Poly A 尾巴结构可通过转录模板的设计添加，也可在转录后通过酶法进行加尾，Poly A 尾巴的添加效率和分布是mRNA 疫苗的质量控制参数之一。质谱是一种无标记的直接测量技术，在适宜的长度前提下能够通过单核苷酸的质量差异进行区分，而mRNA长度通常为几千个核苷酸，长度超过质谱的检测能力， 如需对Poly A 尾巴进行长度分布和含量的分析，则需要对mRNA 的Poly A 进行酶切处理。Beverly等[14] 介绍了一种分析Mrna Poly A 尾巴长度的方法， 该方法基于核糖核酸酶T1（RNaseT1）将Poly A 从mRNA 序列上进行切割，通过dT 磁珠特异性捕获Poly A，然后借助LC-MS 技术的高分辨率，定量分析mRNA的Poly A 尾巴长度分布。Gao等[15] 利用特定的RNase T1 将mRNA 的Poly A 尾巴进行切割，利用质谱对Poly A 尾巴进行分子量测定，确认了两组Poly A 尾巴的长度分布，如图8 所示，并进行了相对含量测定。
2.4.3 mRNA 递送系统LNP 相关分析
mRNA 疫苗开发过程中主要面临三大问题：①核酸分子在体内的不稳定性；②核酸分子潜在的不良反应；③核酸药物递送系统开发难度大。脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle，LNP）是目前核酸药物研究应用最多的递送系统之一[16]，其能够安全有效地递送核酸。LNP 与其他转基因传递载体相比具有很多独特之处，不仅拥有高效的封装率，而且对于待测mRNA 的大小没有限制。除此之外，其还可以在不诱导免疫原性的情况下刺激先天免疫系统，将mRNA 结合到LNP 中以保护mRNA 免受酶的攻击，并增强细胞的摄取和表达。LNP 通常由4 种结构脂组成：①阳离子脂质，药物转染中起主要作用；②中性脂质，如胆固醇，起到稳定纳米颗粒结构的作用；③ 两性脂质，辅助性脂质，能够加快LNP在细胞中的结构转化，加速药物释放；④聚乙二醇脂质，能够提高纳米颗粒整体的稳定性，延长纳米颗粒药物在血液中的代谢时间。
2.4.3.1 脂质组分及其杂质的鉴定和相对定量分析
可电离脂质在配方中的占比通常为总脂质的20%~40%。目前，许多研究人员致力于微调可电离脂质的性质以进一步提高效率，尤其在难以到达的人体组织中递送效率的提高。可电离脂质的整体结构可分为3 个部分：头部、连接片段和尾部。可电离脂质的头部基团通常带有正电荷。头部基团的大小和电荷密度主要参与包裹核酸， 稳定LNP， 与细胞膜相互作用及促进内体逃逸等过程。连接片段可以将头部与尾部连接起来， 连接片段会影响LNP 的稳定性、生物降解性、细胞毒性和转染效率等。疏水性尾部会影响药物的解离常数（pKa），亲脂性、流动性和融合性，从而影响LNP 的形成和效力。常见的可电离脂质有DLin-MC3-DMA（MC3）、 SM-102和ALC-0315，关于其成分的鉴定及潜在杂质和降解产物的分析，是mRNA 疫苗分析的关键质量属性之一。LC-MS 技术可简单、快速地分析LNP 中的脂质成分，如图9 所示，并对其中的杂质和降解产物进行快速确认以及相对定量[17]。
2.4.3.2 脂质的氧化及位点确认
有研究表明，可电离脂质的氧化可能导致mRNA 的共价修饰并使mRNA 效价下降。CID技术不能提供氧化位点信息，而EAD 技术是鉴别脂质氧化位点的关键技术。利用EAD 产生的独特片段离子，可精确区分2 种同分异构体中一个发生氧化修饰和另一个双键被还原相关杂质的确切位置，这些信息可以用来确定LNP 配方的疗效和安全性。Crowe等[18] 使用EAD 鉴别MC3 的2种氧化杂质异构体，EAD 产生的二级谱图可用于识别和区分2 个含氧异构体。如图10 所示，质荷比为 558.5、574.5 和587.5 处的特征离子表明，杂质1 烷基链的C6 处含氧；质荷比为61.05的片段离子表明杂质2 中氧的修饰位点在叔胺（形成N- 氧化物）上。此外，该方法还可以为新型合成脂类的合理设计提供帮助。
3、LC-MS 技术在疫苗辅料和佐剂分析中的应用
药用辅料（pharmaceutical excipients）是指生产药品和调配处方时使用的赋形剂和附加剂，是除活性成分或前体以外，在安全性方面已进行合理的评估，一般包含在药物制剂中的物质。在作为非活性物质时，药用辅料除了赋形、充当载体、提高稳定性外，还具有增溶、助溶、调节释放等重要功能，是可能会影响到制剂的质量、安全性和有效性的重要成分[19]。疫苗的辅料检测方法及检验标准相对研究较少，与传统的小分子药物不同，疫苗的辅料一般为高分子材料，有一定分子量分布，而非单一的成分。例如，通过加入辅料聚山梨酯80 来稳定蛋白或引入LNP 等手段提高mRNA 生物相容性和稳定性[20]。佐剂（adjuvant）又称为免疫调节剂或免疫增强剂，是疫苗的重要辅料，根据化学性质大致可以分为：无机盐类佐剂（如常用的氢氧化铝和磷酸铝）、乳剂型佐剂（如MF59 和AS03 佐剂）、水溶性佐剂（如皂苷QS-21）、微粒抗原呈递系统佐剂（如AS01 和Matrix-M 佐剂）、细胞因子类佐剂（ 如IL-2 和IL-12） 等[21]。这些辅料的结构中多无紫外吸收基团以及在制剂中含量较低，因此对其分析与评价也面临着巨大挑战。
LC-MS 技术适用于分析含量低、不易分离或缺乏紫外吸收的物质， 成为辅料或佐剂定性定量分析的重要研究手段。目前，已有一些针对生物制药领域比较热门的辅料和佐剂分析的LC-MS 技术，为生物制品中辅料或佐剂分析方法的开发提供了参考。聚山梨酯，又名吐温，是一类非离子型表面活性剂类辅料，可以最大限度地减少生物制品的聚集、变性和表面吸附，例如常用的聚山梨酯20 和聚山梨酯80。Peronin 等[22] 建立了一种基于LC-MS 技术定量分析在含蛋白和铝佐剂的复杂疫苗基质中的辅料聚山梨酯20 和聚山梨酯80 的方法，将聚山梨酯碱性水解释放月桂酸和油酸，采用LC-MS 技术在负离子模式下测定了21 份疫苗样品中的月桂酸和油酸。AF03是一种基于角鲨烯的乳液，由角鲨烯、脱水山梨醇油酸酯和鲸蜡硬脂醇聚醚-12 组成，已被用作疫苗佐剂，例如用于已上市的流感疫苗Humenza™ 中。采用高效液相色谱- 电喷雾电离- 质谱（HPLC-ESI-MS）技术可对复杂乳液基质中的2 种表面活性剂脱水山梨醇油酸酯和鲸蜡硬脂醇聚醚-12 进行定量测定，该技术除了应用于AF03 佐剂制备过程中的质量分析与控制外，还可以进一步评估含AF03 佐剂配方的质量及稳定性，为疫苗质量控制中原料鉴定、配方工艺开发和乳液表征提供了有效技术[23]。
4、结 语
质谱技术作为一项重要的分析技术，被广泛应用于生物制品的结构表征分析。本文详细综述了LC-MS 技术在疫苗研究中的作用，主要涉及重组蛋白疫苗、病毒疫苗、多糖蛋白结合疫苗、核酸疫苗的分析。对于重组蛋白疫苗，LC-MS 技术可以从多个维度对其进行全面表征，包括精确分子量分析、肽图分析（序列覆盖度、翻译后修饰等）、二硫键分析，还可以实现目标蛋白的准确定量分析。对于病毒疫苗和多糖蛋白结合疫苗，LC-MS 技术可以进行完整分子量和肽图的分析。对于核酸疫苗，LC-MS 技术可应用于其生产的多个环节并对其质量进行评估，包括mRNA加帽效率分析、尾巴分布分析等。此外，还可以对其药物递送系统LNP 进行主要脂质组分及其杂质的鉴定和相对定量分析，借助于EAD 技术还可对其氧化位点进行有效分析。LC-MS 技术的使用促进了疫苗开发领域的不断发展，同时也为疫苗监管机构提供了强有力的分析工具，有效保证了疫苗产品的安全可靠。随着疫苗产品的不断涌现，以及监管机构对疫苗产品的监管力度加强，LC-MS 技术将会在疫苗领域发挥更大的作用。
引用本文
李阳,宋洋,王文涛,生宁,罗继,郭立海,张金兰*,陈泓序*.液相色谱-质谱联用技术在疫苗分析中的应用[J].中国食品药品监管,2023(7):30-43.
