亚硝胺杂质已成为悬在药监部门与生产商头顶的达摩克利斯之剑，威胁着上市药品的质量与患者的用药安全。虽然亚硝胺杂质（Nitrosamines）也有可能是基因毒性杂质（Genotoxic Impurities），但基因毒性杂质和亚硝胺杂质是单独的两个评估模块，他们有各自细分的法规要求，亚硝胺杂质的控制更严格。
亚硝胺杂质还是要研发人员基于风险评估（评估几大要素包括工艺本身、回收溶剂、物料，包材，水等）、ICH限度计算以及三批检测结果来最终制定控制策略，具体如下所述：
一、 杂质限度制定
1、 仅有一种（亚硝胺）杂质：按照限度（AI/MDD）进行质量控制
①一般亚硝胺杂质/非NDSRIs：
▲表1-主流国家官方亚硝胺限度要求
②原料药亚硝胺相关杂质NDSRIs：
对于NDSRIs，FDA推荐了一种根据预测的致癌效力分类分配推荐限度的方法，如下表所示：
▲表2-NDSRIs物种预测致癌效力分类和相关AI限度
关于上表中NDSRIs预测致癌效力分类方法和相关AI推荐限度确认流程如下图所示：
注：上述决策树中α-C及下文β-C含义如下图：
▲图1-NDSRIs致癌效力分类预测和确认推荐限度流程图
上图中致癌效力评分由如下3个部分组成：α-氢评分（表3）+失活特征评分（所有出现的结构特征得分之和） （表4）+激活特征评分（所有出现的结构特征得分之和） （表5）。
▲表3-每个α-碳上的氢原子计数和相应的α-H得分情况
注：当亚甲基α-碳不是乙基的一部分时，得3分。当亚甲基α-碳是乙基的一部分，得2分。
▲表4-失活特征及相关评分列表
注：*不包括N-亚硝基位于吡咯烷环、至少含有一个硫原子的六元环或吗啉环（全部分开计算）中的例子。
**不包括羧酸和芳基（单独计算），以及酮（数据冲突）。其它的吸电子基团示例仅限于Cross KP和Ponting DJ, 2021, Developing Structure-Activity Relationships for N-Nitrosamine Activity, Comput Toxicol, 20:100186中描述的那些，文献中它们被称为“β-碳吸电子基团”。
***β-碳必须处于sp3杂化状态，这一规则才适用。
▲表5-激活特征和相关分数列表
举例说明：
案例1 N -亚硝基-l-奈比洛尔
效力得分=1+2+1=4，效力分类4级对应的AI推荐限度为1500ng/天。
案例2 N -亚硝基-氯胺酮
▲图2-N-亚硝基-氯胺酮致癌效力分类确认思路
其它FDA公布的NDSRIs推荐AI限度详见附件1（如需要附件，可转发文章，凭借截图联系注册圈管理员获取）。
2 、多于一种（亚硝胺）杂质
EMA：根据决策树两种控制方式（①所有检出的N-亚硝胺的总日摄入量不超过所检出的限度最低的N-亚硝胺的AI值；②各亚硝胺杂质实际检出值与其限度比值的总和不大于100%）；
FDA：如果发现不止一种亚硝胺杂质（NDSRIs和/或小分子亚硝胺），且亚硝胺的总水平超过了基于最大日剂量的药品中最强效亚硝胺（限度最低的AI），则持有人应联系FDA当局。如果个别亚硝胺的推荐AI限度差异很大，FDA鼓励持有人提出一个不同于推荐的检测到的最有效的亚硝胺杂质AI的亚硝胺限度，并与FDA当局联系确认。
二、控制策略
FDA：原控制策略超过LOQ（0.03或0.02根据MDD）ppm需要报告；
法规来源：2021-02，Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs （Guidance for Industry）：
The LOQ may be considered the reporting threshold for nitrosamine impurities （i.e., the limit above which an impurity should be reported in the certificate of analysis）.
2023年8月更新后：NDSRIs限度根据已有毒理学数据已经放宽，但暂未明确更多配套控制策略。
法规来源：2023-08，Recommended Acceptable Intake Limits for Nitrosamine Drug Substance- Related Impurities （NDSRIs） Guidance for Industry
EMA：方法灵敏度做到限度的30%以下，并三批商业批数据未检出，API中定期检测；方法LOQ做到限度的10%以下，并三批商业批数据未检出，则可以免检。
法规来源：
Questions and answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5（3）of Regulation （EC）No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal products ：
If quantitative testing is performed as a routine control, the LoQ should be s of the acceptable limit based on the relevant acceptable intake （AI）for the respective nitrosamine impurity;
If quantitative testing is performed to justify skip testing, the LoQ of the analytical procedure employed should be s 30%of the acceptable limit based on the AI.
三、亚硝胺杂质研究决策树
▲图3-亚硝胺杂质研究决策树
对于亚硝胺杂质的研究需要我们遵循质量源于设计的理念，在项目开发过程中就充分将其考虑在内，比如：在工艺路线开发的时候，应尽可能减少或避免可能引入可能携带亚硝基试剂的溶试剂的使用，并对其制定严格的控制策略，包括供应商审计、质量保证协议、工艺路线清除设计等，都应该进行全面深入的设计。样品的检测在工艺路线确定以后，就应该完成相关分析方法的开发，对其制备样品进行检测和多批次数据收集，为未来限度制定提供充分的依据。
各国药监机构对于亚硝胺杂质的关注度日趋重视，国内外对于亚硝胺杂质的法规也日趋完善，尤其是原料药相关的亚硝胺杂质（NDSRIs）。NDSRI亚硝胺杂质通常没有明确确定的允许摄入量AI，为此FDA和EMA给NDSRI设定了苛刻的AI值。如FDA指定的临时AI为26.5ng/天；EMA为新的NDSRI设定了18ng/天的临时AI。随后EMA引入了178ng/天的临时AI，直到数据可以证明其确切的AI。这种临时AI的使用时间为1年过渡期。这种限度设定缺乏合理性，给药企带来了很大的挑战难度。
2023年7月底8月初，EMA及FDA先后发布了更加合理化的亚硝胺的控制策略，FDA在官方发布了基于上述控制策略一系列NDSRIs的临时AI限度。相对于上一版的总杂0.03ppm的控制要求，已经有了很大的改善。关于质量控制策略，企业也有了更多的发言权和参与机会。随着国内外研究的不断深入，毒理数据的日趋完善，将来有望改善亚硝胺风险评估、限度、研究控制策略及各国药监机构监管的日趋明朗和合理化。
参考文献
1. Questions and answers for marketing authorization holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5（3） of Regulation （EC） No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal products，EMA/409815/2020 Rev.17；
2. Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs Guidance for Industry，FDA，February 2021，Pharmaceutical Quality/ Manufacturing Standards/ Current Good Manufacturing Practice （cGMP，Revision 1）.
3. Nitrosamine impurities in medicines -Information for sponsors and manufacturers, TGA，20 July 2022.
4. WHO Information Note ：UPDATE ON NITROSAMINE IMPURITIES，WHO，20 November 2019.
5. ICH. M7（R1） Assessment and control of DNA reactive （mutagenic） impurities in pharmaceuticals of limit potential carcinogenic risk [EB/OL］.（2017-03-31）。
6. Workflows for Quality risk management of nitrosamine risks in medicines ,EPIFA，Version 2.0 ，Aug 2022.
7. Recommended Acceptable Intake Limits for Nitrosamine Drug Substance- Related Impurities （NDSRIs） Guidance for Industry，FDA, 04 August，2023.
8. Questions and answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5（3）of Regulation （EC）No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal products，EMA，28 July，2023.
