近期，河北医科大学第三医院陈伟教授和河北工业大学杨磊教授在科爱出版社创办的期刊Bioactive Materials上联合发表综述文章：纳米材料加速骨折愈合的研究进展。从纳米材料的固有特性、纳米材料用于骨缺损填充以及纳米递送系统在治疗骨折愈合中的应用三方面入手，详细总结了纳米材料在加速骨折愈合中的最新研究进展，并指出了纳米材料加速骨折愈合的挑战和未来发展方向。
研究内容简介
骨折病例逐年增多，骨折后出现不愈合或延迟修复的患者数量也逐年增加。尽管目前的临床材料（如金属和复合材料）有助于骨折愈合，但由于其降解速度缓慢，成骨活性有限，骨整合能力不足，力学性能欠佳等原因无法满足需求。自2000年以来，纳米材料成功模仿了骨骼的纳米尺度特征并提供了独特的性能，因此备受关注。本文综述了纳米材料在治疗骨折方面所取得的成就，如纳米材料的固有特性、用于填充骨缺损的纳米材料以及治疗骨折延迟愈合的纳米递送系统。此外，文中还探讨了纳米材料加速骨折愈合所面临的挑战和未来的发展方向。
一、纳米材料的固有特性
作为组织工程学的重要组成部分，纳米技术近年来迅速发展，所创造出的纳米材料已广泛应用于生物医学领域，例如药物递送、组织再生、伤口愈合、基因递送及成像技术等。近年来，越来越多研究表明纳米材料的固有特性同样重要。在加速骨折愈合治疗中，纳米材料的固有特性主要体现在抗氧化、抗菌、促进成骨细胞分化和抑制破骨细胞分化等方面。
1.1 纳米材料的抗氧化作用
在炎症反应期间，炎症细胞（包括中性粒细胞、白细胞和巨噬细胞）会聚集到受炎区域并释放促炎因子，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）以及白细胞介素6（IL-6）。这些因子导致线粒体电子传递链（ETC）的代谢出现紊乱，因为它们会诱导活性氧（ROS）的泄漏。因此，可以使用抗氧化物质来抵消炎症反应产生的过量ROS，从而有效地抑制炎症。
典型的纳米金属化合物，如氧化铈（CeO2）和二氧化锰（MnO2），具有显著的抗氧化作用。这些化合物在促进骨折愈合和抑制炎症反应方面特别有效。例如，Wu等人通过在介孔二氧化硅中负载CeO2，得到介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs）-CeO2复合材料，表现出优异的比表面和高吸附率。该材料在严重氧化应激模型创面中可以有效消除局部过量的ROS，缓解氧化损伤，缩短创面修复周期（图1）。
图1：使用MSN-CeO2作为ROS清除组织粘合剂快速修复皮肤伤口和组织再生的示意图。
1.2 纳米材料的抗菌作用
创伤感染问题是临床骨缺损修复面临的挑战。一旦出现局部状况，细菌就会侵入并占据有缺陷的组织表面和植入材料。它们繁殖消耗营养物质和氧气，并释放酸性代谢物，这对周围的健康细胞或难以附着到缺陷部位和植入材料的迁移细胞产生不利影响。
周围免疫细胞因细菌增殖而分泌重要的促炎因子，加剧炎症反应和ROS积累。此外，骨组织中活化的破骨细胞引起破骨细胞分化和骨吸收，从而导致骨修复失败。因此，一些纳米材料凭借其抗菌特性，因此，一些纳米材料凭借其抗菌特性成为研究人员关注的焦点。
1.3 纳米材料促进成骨分化
纳米材料已广泛应用于骨再生治疗。生物活性分子和纳米材料的复合可加速新骨的形成。但是，研究人员更加关注纳米材料自身是否可以促进成骨分化。在无机非金属纳米粒子的研究中，Xu等人研究了针状、棒状和层状纳米羟基磷灰石（nHAp）颗粒对成骨分化的影响（图2A）。结果表明，片状nHAp颗粒独特的分层结构可以显著提高细胞内吞效率，调节肌动蛋白细胞骨架，激活丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路（图2B和C），上调间充质干细胞的成骨分化。
图2：（A）不同层次结构的HAp MPs影响干细胞成骨分化调控的可能机制示意图，（B）在三种HAp MPs培养的mBMSCs中，ERK、JNK和p38信号通路中必需蛋白的表达，（C）灰度值水平相对于GAPDH的倍数变化，n = 2。
1.4 纳米材料抑制破骨细胞分化
破骨细胞又叫做骨吸收细胞，源自单核-巨噬细胞系统，在骨的生长、发育和修复中发挥着重要的作用。骨的形态和吸收是动态平衡，受到多种因素的调节，一旦这种平衡失衡，就会引发多种疾病。目前，抑制骨吸收的新型纳米材料的开发受到广泛关注。
例如，Ai等人研究表明，氧化铁纳米颗粒（IONPs）可被骨髓瘤内化，同时抑制核转录因子NF-κB受体激动剂配体（RANKL）诱导的骨髓瘤在细胞分化早期和成熟后期向大型多核破骨细胞的分化。相反，它们不影响细胞增殖和融合（图3A）。IONPs通过激活骨髓来源的巨噬细胞（BMMs）中Toll样受体-4（TLR-4）-Nrf-2信号上调p62，促进去泛素化酶CYLD向肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）募集，促进TRAF6-p62-CYLD复合物结合，导致TRAF6去泛素化。从而导致RANKL和核因子-κB受体激活因子（RANK）联合诱导的NF-κB和MAPK的一系列信号通路（JNK、ERK、p38）被阻断。最后，下游破骨细胞相关基因（NFATC1）转录可被显著抑制，导致骨吸收不足。图3B显示了IONPs抑制RANKL诱导的破骨细胞形成的分子机制。
图3：IONPs对RANKL诱导的破骨细胞生成的抑制作用。（A）系统给药后，通过BMMs的吞噬作用，IONPs滞留在骨髓中，IONPs可以抑制RANK诱导的早期分化和晚期成熟阶段的破骨细胞发生，（B）RANKL诱导破骨细胞发生抑制作用的分子机制。
二、用于骨缺损填充的纳米材料
健康人骨骼的连续性和完整性都非常高。然而，由于创伤或其他原因造成的骨骼缺陷，骨骼部分被破坏或缺失等，在机体自我修复中，新生骨的充足体积是恢复外观和功能所需的必要条件。目前，临床往往采用植入骨移植物填补骨缺损，通常使用自体骨或同种异体骨。但这些治疗方案耗时长，疗效不佳。为了解决这些问题，研究人员注重于开发具有抗菌和骨诱导性能的新型纳米生物材料，将其作为骨缺损填充材料应用于骨折愈合的治疗。
2.1 羟基磷灰石（HAp）纳米粒子
通过模拟天然骨的组成和结构特征制备的骨替代材料可以为细胞提供与天然骨相似的微环境，可作为骨缺损的直接修复材料和组织工程的优良载体材料。HAp（Ca10(PO4)6(OH)2）是人类骨骼的主要无机成分，具有良好的生物相容性和生物活性。在体内植入HAp后，由于其吸收缓慢，可以保持与再生骨的整合。因此，HAp通常用作聚合物的填料，以改善其机械性能，并涂覆金属植入物以提供更好的生物活性。
2.2 碳基纳米材料
同素异形体石墨烯是一种由sp2杂化碳原子构成的单层六边形晶格的碳晶体形式，它是石墨、木炭、碳纳米管和富勒烯等碳同素异形体的基本构成成分。一些研究探讨了将碳基纳米材料应用于体内骨组织工程中的可能性。碳纳米材料支架具有易得、生物和机械相容性好等优点，这些支架对成骨分化、细胞增殖和骨组织再生产生显著的影响。作为骨干细胞发育、扩张、更新、粘附和分化的模板，支架在形成骨组织过程中起着至关重要的作用。纳米碳纤维能够加速成骨细胞的增殖，促进碱性磷酸酶的合成，相较于大直径碳纤维，它还可积累更多的细胞外基质钙，该材料在应用于骨组织时还表现出更好的力学性能。
作者全面归纳了羟基磷灰石纳米粒子和碳基纳米材料在骨缺损修复中的优点和局限性（表1）。
表1 总结了纳米材料在骨缺损修复中的优势与局限性。
三、纳米药物递送系统
纳米级药物载体的尺寸范围为10-1000nm，能够与药物分子形成药物缓释体系，通过化学键和物理吸附等方式进行。纳米载体的应用可以改善药物的缓释、靶向性、稳定性、作用时间和给药途径，从而减少全身或局部给药的副作用。此外，纳米载体能够穿透传统药物作用的机体屏障，如血脑屏障、血眼屏障和细胞生物膜屏障，以提高疗效。作者对几种纳米级药物递送系统和纳米药物载体（如硅基、聚合物、水凝胶基纳米药物载体、纳米脂质体和金属有机框架(MOF)）在促进骨折愈合方面的研究工作进行了归纳总结。
3.1 硅基纳米药物载体
硅纳米颗粒（MSNs）的孔径为2-50纳米，粒径为数百纳米至数十微米，表面积高达1000平方米每克。每平方米约有5×1018个硅烷醇基团，可被功能化以用于多种用途，因此它们广泛应用于骨组织工程中开发控释系统。此外，Si离子是启动骨基质矿化的关键因素，它可以从MSNs中持续释放，积极促进骨生成和血管生成。
3.2 纳米脂质体药物载体
脂质体是一种囊泡结构，最早由Stanham等人在1965年通过电子显微镜观察分散在水中的磷脂发现。它是由脂类，如卵磷脂、鞘磷脂和磷脂酰胆碱组成的中空结构，具有细胞样的外观，外层是亲水的头部和内层是亲脂的尾部。药物在脂质体中负载后，其在组织中的扩散速度和在血液中的释放速度减慢，从而可以延长药物的作用时间。
例如，Liu等人采用焦磷酸胆固醇作为靶向配体，将丹酚酸A负载到脂质体中，形成直径约160 nm的体系。该系统显著缩短了骨折愈合时间，减少了22天，加速了治疗过程（图4A）。Chen等人则基于负载天冬氨酸和淫羊藿苷的脂质体，建立了一种可靶向骨组织、有效防止骨吸收和骨坏死的递送系统（图4B）。Anada等人则开发了一种新的磷酸钙结合脂质体，该脂质体具有优异的HAp亲和力（图4C）。在阿霉素加药后，该脂质体显著减少了人骨肉瘤MG63细胞的数量（图4D和E）。由此可见，脂质体可作为有效的药物载体，并实现对骨组织的靶向修复，进一步为治疗其他骨相关疾病（如骨质疏松症和类风湿性骨关节炎）提供了新的思路。
图4：（A）骨靶向丹酚酸A脂质体用于延迟骨折愈合，（B）负载天冬氨酸和淫羊藿苷的脂质体作用示意图，（C）磷酸钙脂质体对HAp的亲和力，（D）负载阿霉素脂质体（含和不含BPA）的细胞毒性与初始药物浓度的函数关系，（E）不含阿霉素的脂质体的细胞毒性与脂质体浓度的关系比较。结果为平均值±SD (n = 3)。
3.3 高分子纳米药物载体
高分子纳米载体分为天然高分子材料和人工合成高分子材料。高分子材料以其多功能性、来源丰富、分子量分布差异大等特点，被广泛应用于众多工业领域。此外，一些高分子材料因其优异的可降解性和生物相容性而成为纳米药物载体。
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）、聚乳酸（PLA）和聚己内酯（PCL）等聚酯在药物装载和递送方面受到广泛关注。PLGA可携带蛋白质、多肽、疫苗基因、生长因子、抗原和其他大分子药物。PLGA微球进入人体后，缓慢降解，逐渐释放药物，实现长期缓释。Fu等人在大鼠临界尺寸颅骨缺损的研究中发现，具有药物载荷能力的快速可吸收壳聚糖（CS）骨置换联合成骨诱导SIM/PLGA可显著提高成骨和血管生成活性，同时促进骨折愈合，成为临床使用的骨替代品。上述特殊的骨替代物组合可能会改善CS骨替代物植入早期骨痂形成的生物力学支持（见图5A和B），因此可用于修复重大骨缺损。2023年，Geng等研究人员将黑磷纳米片（BPs）和褪黑激素与阿仑膦酸偶联PLGA纳米球结合，开发出多功能纳米平台治疗骨质疏松性骨折。当暴露在近红外辐射下时，BPs在光热治疗中发挥特殊作用，它们与PLGA结合可以增加稳定性，通过轻度热疗促进成骨，副作用少。褪黑素能够通过抑制破骨细胞生成和促进成骨来控制骨代谢（见图5C）。
图5：（A）移植骨替代物后8、10和12周的颅骨缺损组织学标本，苏木精-伊红染色，（B）移植骨替代物后8、10和12周新骨基质形成的组织学定量研究。**与对照组比较p<0.0001，治疗组间p<0.0001，（C）近红外照射治疗骨质疏松性骨折的多功能纳米平台示意图。
3.4 金属有机骨架（MOFs）作为药物载体
MOFs是指有机和无机成分相结合的杂化材料。在上世纪90年代被首次开发后备受推崇，因为它具有高孔隙率、比表面积和结构可调性。基于MOFs的复合骨材料表现出独特的性能，这吸引了许多研究人员的关注。通过将金属离子固定在MOFs的结构中，可以控制功能离子的释放，这种修饰可以实现抗菌和抗感染的作用，帮助伤口愈合，增强ALP活性并在成骨过程中扮演重要角色。与其它材料相比，纳米结构的MOFs具有靶向输送的特性，可减少骨质流失并促进骨再生。
3.5 纳米水凝胶药物载体
水凝胶是一种具有亲水性聚合物链的三维网络结构，含水量为90%-99%，有利于氧气和物质的高效交换。水凝胶以其高生物相容性、低免疫原性和可调节的理化性质在生物医学领域取得了前所未有的进展。水凝胶聚合物体系为细胞移植和分化、内源性再生、生物修复、伤口愈合和持续给药提供了合适的底物。相反，其三维网络系统可以模拟原始细胞外基质的微观结构，为细胞存活提供活的生态条件。然而，一般情况下，该材料无法对内源性环境刺激或自然信号做出响应，严重限制了递送系统的发展，使得体内药物的受控释放无法实现。因此，我们可以引入具有独特物理化学性质的纳米材料与水凝胶形成杂化材料，从而为水凝胶体系赋予响应外源性或内源性刺激的功能，更有效地实现药物控释行为。此外，纳米材料还能够更好地成像或监测药物释放行为，实现更精确的靶向治疗。
通过控制载药方式和释放动力建立局部缓释药物的体系，优化纳米材料的性能，使其在抗菌和诱导骨生成方面达到最优效果，同时尽量减少其对细胞的毒性和在生物体内的降解速度。这一领域研究可以为骨折治疗的临床应用提供更多的可能性。作者在表2中列出了不同纳米级给药系统的优缺点。
表2 总结了纳米载药系统的优势与局限性。
最后作者指出常用的内固定设计不能充分地模拟人体骨关节的生物学特性和机械支撑传导特性。它无法有效地恢复骨骼的标准结构和功能，也无法分析人体骨骼和关节的结构及生物力学功能，因此面临着开发可吸收的纳米复合人造骨材料等一系列挑战。未来的科研人员应更深入地了解纳米材料的特性，精准配方多孔无机纳米材料以增强其与天然骨的相似性，以及识别可以有效用作药物载体的材料，以期为骨折愈合的治疗和临床应用带来突破性进展。
原文信息
Mo Zhang, Fan Xu, JingchengCao, Qingqing Dou, Juan Wang, Jing Wang, Lei Yang**, Wei Chen*.
Research advances of nanomaterials for the acceleration of fracture healing.
BioactiveMaterials, 31(2024) 368-394.
