众所周知，基因毒性杂质具有致突变性和/或致癌性，会对DNA造成极大的损伤，进而严重危害人类的生命健康。因此，无论食品、药品、化妆品领域，对于基因毒性杂质的控制要求极其严格，而在药品领域最为严格。常见的基因毒性杂质类型有黄曲霉毒素、苯并芘胺、亚硝胺。这类杂质的有效控制离不开稳定、准确、可靠的分析方法，本文汇总了药物中常见的基因毒性杂质分析方法，主要包括前处理方法和定量方法，旨在为广大研究者在基因毒性杂质分析方法的选择、开发和验证提供思路。
一、前处理方法
传统的前处理方法包括用溶剂直接溶解、浓缩、沉淀、离心、萃取、衍生化法等。其中，用溶剂直接溶解是最简捷、最实用的方法，此方法几乎可避免组分损失，供试品溶液最具代表性，关键在于选择合适的溶剂，但有的组分不易寻找良溶剂或供试品溶液的测试灵敏度欠佳，或基质干扰较严重，此情况下则需选用其他的前处理方法。然而，其他的前处理方法各有弊端：浓缩法消耗时间较长；离心法引起的误差较大；沉淀法、萃取法有机溶剂消耗大，污染环境，影响操作人员健康；衍生化法处理时间较长，且有时衍生试剂不易寻找，加入量不易控制。以上各前处理的操作均不如直接溶解法那样简捷。
近年来，随着前处理技术的不断进步，几种新型前处理方法相继面世，如固相萃取法（SPE）、固相微萃取法（SPME）、液相微萃取法（LPME）、加速溶剂萃取法（ASE）、微波萃取法（MAE）、超临界流体萃取法（SFE），其中应用较广的为固相萃取法（SPE）和固相微萃取法（SPME）。固相萃取法具有净化与富集效果好；样品制备快速、涉及人工少、溶剂用量少；分析结果的精密度较高(偏差常<5 %)；多样化的产品设计可迎合不同样品通量要求等优点；固相微萃取法除了具备固相萃取法的制备快速、操作简便、易自动化外，需要的溶剂用量更少甚至无需洗脱溶剂，所需的样品体积也较少，还易于和其他技术联用。新型前处理技术的出现，既去除了样品基质中较多的杂质，很好地减弱了基质效应的影响，又改善了传统前处理方法的操作复杂、耗时、溶剂消耗量大等缺陷，代表了未来前处理技术的发展方向。
二、定量方法
定量方法常见的有气相色谱法（GC）、液相色谱法（HPLC）以及色谱-质谱（MS）连用法，如GC-MS、GC-MS/MS、LC-MS、LC-MS/MS，此外还有热能分析法（TEA）、紫外光谱法（UV）、离子色谱法（IC）等。
2.1 气相色谱法（GC）
GC法适用于挥发性较好，热稳定性较强的化合物，如N-亚硝胺类、烷基磺酸酯类、卤代烷烃类、环氧类等某些杂质。此方法也是最早被发现的针对基因毒性杂质的分析方法—1981年由Castegnaro M[1]等首次用GC-TEA法对含氨基拉明、二硫磷和土霉素的药物进行N-亚硝胺类化合物的检测。GC 的进样方式包括直接进样和顶空进样（HS）：前者更适合高沸点的物质，但基质污染较大，前处理过程往往较复杂；后者的前处理过程较简单，基质污染少，可提高灵敏度，但是对于不易挥发、高沸点的物质不太适用。但是GC法灵敏度较低，仅适用于基因毒性杂质含量高且溶解性好的原料药或制剂。随着近年来ICH和各国药物监管部门对基因毒性杂质提出了更高的控制要求，此类杂质的限度也非常低，通常在100 ppm以下，因此对于仪器灵敏度的要求也随之提高，这就导致GC法在基因毒性杂质分析方面应用并不广泛。
2.2 气相色谱-质谱联用法（GC-MS）
GC-MS法目前在测定基因毒性杂质方面得到了较为广泛的应用，该法利用了质谱仪的准确、快速、灵敏度和分辨率高等优点进行定性和定量分析，解决了单独用GC时方法灵敏度低的问题，检测限甚至可低至1 ppb[2]。还能最大限度减少干扰，满足基因毒性杂质痕量分析的要求。GC-MS的电离方式主要有电子轰击离子化（EI）和化学电离（CI）两种，分析器主要是单四极杆（MS）和三重四极杆（MS/MS）。若杂质限度在 1~100 ppm，可以采用 GC-MS 方法，通常采用EI电离 模 式 ；若杂质的限度低于 1 ppm，推荐使用 GC-MS/MS 法。一般情况下，三重四极杆可降低基质干扰（共流出物的碎片或同位素峰）引起的假阳性的发生率，因此三重四极杆的灵敏度和准确度更高。
GC-MS法在亚硝胺类、甲磺酸酯类、缬氨酸衍生物等杂质方面应用较为广泛。各国药典和药物监管部门也收录了许多运用GC-MS的检测方法，详见表1，其中，GC-MS法在沙坦类药物的分析较为成熟，广大研究者可引以为鉴。
▲表1-各国药物监管部门和药典收录的部分GC-MS法
2.3 液相色谱法（LC）
液相色谱法（LC）适用于分析沸点高或沸点低但热稳定性差的物质，主要适用的基因毒性杂质有芳基磺酸酯、芳香胺，亚硝胺类杂质也适用于LC法。然而，采用液相色谱法（LC）分析基因毒性杂质，关于这方面的报道比较少，主要原因与GC法相同：LC法适用的杂质限度通常在100 ppm 以上[11]，但是各国药品监管部门普遍对这类杂质限度要求及其严格，如目前EMA 和FDA 对N-亚硝胺类杂质要求不得超过30 ppb [12, 13]。因此，LC法的灵敏度不足限制了其在基因毒性杂质领域内的应用。从各国药品监管部门的收录情况来看，只有法国国家药品和保健品安全管理局发布了HPLC-UV法检测缬沙坦原料药及制剂中NDMA[14]。其他研究者的报道中，谢卫锋等[15]建立了一种快速简便的HPLC法对托吡司特中的对甲苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸仲丁酯和对甲苯磺酸乙酯进行了测定。
2.4 液相色谱- 质谱联用法（LC-MS）
液相色谱- 质谱联用技术（LC-MS）具有高灵敏度、高分辨力、快速分析、结果准确的特点，能够满足痕量毒性杂质测定的要求[16]。此方法已逐步取代LC法用于痕量杂质的分析，在基因毒性杂质领域（尤其是挥发性和热稳定性较差的杂质）应用较广泛。另外，LC-MS法相对GC-MS法灵敏度更高，离子源和分析器种类也更多。离子源最常用的是电喷雾电离源（ESI）和大气压化学电离源（APCI）；分析器除了单四极杆（MS）和三重四极杆（MS/MS）外，还包括飞行时间分析器（TOF）、轨道阱（Orbitrap）和离子阱（Iontrap）等。目前液质联用技术中应用最广泛的分析方法是LC-MS/MS，尤其是对于限度较低（<1 ppm）的杂质而言，此法是最合适的，因为LC-MS/MS 方法可降低基质干扰造成的假阴性（离子抑制）或假阳性（共流出物或同位素干扰）发生可能性，可以满足较严格的灵敏度、专属性和准确度要求。若 杂 质 限 度 在 1~100 ppm， 也可 以 采 用LC-MS 方法，通常采用 ESI 正离子模式 ；但根据离子化基团的特性，ESI 负离子可能在某些情况下更合适，如-COOH ；对于难离子化的化合物，通常采用 APCI。
LC-MS法凭借离子源和分析器种类多的优势，已发展成为在基因毒性杂质分析领域应用最广泛的方法。例如，各国药品监管部门公布的亚硝胺类杂质分析方法中，LC-MS法占据举足轻重的地位（见表2）。其中沙坦类、替丁类、二甲双胍类药物均有研究者成功实现检测，可供借鉴。
▲表2-各国药物监管部门公布的部分LC-MS法
除亚硝胺类杂质外，LC-MS法也适用于芳基磺酸酯、芳香胺类杂质。孙 春 艳等[21]建立的高效液相色谱－串联质谱（HPLC-MS/MS）方法可以同时测定吉非替尼中４种芳香胺类基因毒性杂 质。骆美玉等[22]建立了不需要前处理的HPLC-MS/MS法对盐酸吉西他滨中两种甲磺酸酯杂质—MMS和EMS进行了测定。
LC-MS法在基因毒性杂质定量方面通常采用四极杆分析器（MS），但是也有研究者开发出利用高分辨质量分析器（TOF、Orbitrap）分析此类杂质的方法：徐文峰等人[16]采用高效液相色谱- 四极杆飞行时间质谱（LC-Q-TOF-MS）测定氯沙坦钾及其复方制剂中NMBA。另外，FDA还发布了采用LC-Q-Orbitrap-MS[23]法测定沙坦类药物中NMBA 含量。高分辨质量分析器以其超高分辨力和灵敏度以及超快分析速度的优点，今后也许会在基因毒性杂质定量方面得到越来越多的应用。
2.5 离子色谱法（IC）
对于无机阴离子和阳离子（如叠氮酸、亚硝酸、溴离子等）和有机离子（如生物胺、有机酸、糖类分析等），可以采用 IC 法来检测[11]。例如，无法用 GC法检测到的磺酸酯类杂质可以在碱性条件下水解生成甲磺酸钠，有研究者利用此化学性质建立了合适的IC 法进行分析[24]，IC法能 有 效 提 高 检 测 准确性。也有学者[25]选择离子对试剂四丁基氢氧化铵，建立IC法对氟达拉滨药物中离子形态的三氟甲磺酸酯类杂质进行检测。因此，对于易离子化且稳定性强的基因毒性杂质，IC法是一个合适的选择。
三、总结
自从20 世纪 80 年代末 至90 年代初以来，研究者们对基因毒性杂质的研究从未止步，被探索出的基因毒性杂质种类越来越多。尤其是随着近年来此类杂质不断地在药品中被检出超标（如缬沙坦、雷尼替丁、盐酸二甲双胍……），未来可能还会有更多的药物被检出此类杂质，如此严峻形势下，各国监管部门对此类杂质的控制要求也随之越来越严格……。
对基因毒性杂质的有效控制离不开科学合理的分析方法。目前在此类杂质分析方法开发方面仍然存在两大难点：一方面，如何选择合适的前处理方法，既要尽可能减少杂质的损失，又要尽可能减少基质污染，从而保证测试的稳定性和准确度；另一方面，如何建立通用、简便、灵敏度和准确度高、稳定性好、成本低的定量方法，以保证该方法的适用性。相信随着研究者们的不断努力探索，以上两大难点会逐步得到破解。
本文汇总了基因毒性杂质常用的分析方法，为广大研究者在此类杂质的分析方法开发和验证方面提供参考，不足之处还望批评指正！
参考文献
[1]Castegnaro M, Pignatelli B, Walker EA. Analysis of volatile N-nitrosamines in commercial drugs[J]. Food Cosmet Toxicol, 1981, 19 (4): 489-491.
[2]文松松，谭会洁，杨书娟，等。超高效液相色谱-质谱联用法测定盐酸雷尼替丁及制剂中痕量N-亚硝基二甲胺 [J]. 药学研究，2021, 40 (8): 508-511.
[3]国家药典委员会. 关于缬沙坦国家标准修订稿的公示（第二次）[EB/OL]. [2019/1/2]. http://www.chp.org.cn/view/ff80808167f36c8401680c3d64812849?a=bzhxyp.
[4]FDA.GC/MS Headspace Method for Detection of NDMA in Valsartan Drug Substance and Drug Products [EB/OL]. [2019-01-25]. https://www.fda.gov/media/115965/download.
[5]FDA. Combine Direct Injection N-Nitrosodimethylamine (NDMA) and N-Nitrosodiethylamine (NDEA) Impurity Assay by GC/MS [EB/OL]. [2018-12-12]. https://www.fda.gov/media/117807/download.
[6]FDA. Combined Direct Injection N-Nitrosodimethylamine (NDMA), N-Nitrosodiethylamine (NDEA), N-Nitrosoethylisopropylamine (NEIPA), N -Nitrosodiisopropylamine (NDIPA), and N-Nitrosodibutylamine (NDBA) Impurity Assay by GC-MS/MS[EB/OL]. [2019/4/19]. https://www.fda.gov/media/123409/download.
[7]OMCLS.Determination of NDMA (HS-GC-MS) [EB/OL]. [2018-09-21]. https://www.edqm.eu/sites/default/files/omclndma-method-palg-ie-september2018.Pdf.
[8]中国药典委员会。磺酸盐药物中烷基磺酸酯类杂质检测方法（草案）[S]. 2019-7-22.
[9]The United States Pharmacopeial Convention. USP 35-NF30: Pharmacopeial Forum[S]. 2012, 33(3): 467.
[10]EDQM. Methyl, ethyl and isopropyl methanesulfonate in methanesulfonic acid[S]. EP 80 Strasbourg: Council of Europe, 2011.
[11]朱文泉，马健， 李敏。基因毒性杂质的挑战与控制策略—从ICH指导纲领到实际操作层面 [J]. 中国食品药品监管， 2020 (12): 29-44.
[12]EMA. Angiotensin-II-receptor antagonists (sartans) containing a tetrazole group [EB/OL]. [2019/5/28]. https://www.ema.europa.eu/en/medicines/human/referrals/angiotensin-ii-receptor-antagonists-sar-tans-containing-tetrazole-group.
[13]FDA. FDA updates and press announcements on angiotensin II receptor blocker (ARB) recalls (valsartan, losartan, and irbesartan) [EB/OL]. [2019/11/3]. https://www.fda.gov/drugs/drug-safety-and-availability/fda-updates-and-press-announcements-angiotensin-ii-receptor-blocker-arb-recalls-valsartan-losartan.
[14]OMCLS.Determination of NDMA in Valsartan Active Substances and Finished Products by HPLC/UV[EB/OL].[2018-09-21].https://www.edqm.eu/sites/default/files/omcl-methoddetermination-ndma-valsartan-ansm-september2018.Pdf.
[15] 谢卫锋，高玉珍. HPLC法检测托吡司特中的基因毒性杂质对甲苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸仲丁酯、对甲苯磺酸乙酯[J]. 药物分析杂志, 2018, 38(10): 1788-1793.
[16]徐文峰，金鹏飞，徐硕，等。LC-Q-TOF-MS法测定氯沙坦钾及其复方制剂中痕量杂质N-亚硝基-N-甲基-4-氨基丁酸 [J]. 药物分析杂志，2019, 39 (11): 2047-2050.
[17]FDA. Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (LC-HRMS) Method for the Determination of Six Nitrosamine Impurities in ARB Drugs [EB/OL]. [2019/5/21]. https://www.fda.gov/media/125478/download.
[18]FDA.Liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS) method for the determination of six nitrosamine impurities in ARB drugs [EB/OL]. [2019-06-02]. https://www.fda.gov/media/125478/download.
[19]OMCLS.Test Method for the Determination of NDMA by LC/MS/MS in Valsartan Finished Products [EB/OL]. [2018-09-21]. https://www.edqm.eu/sites/default/files/omcl-methoddetermination-ndma-valsartan-cvua-september2018.Pdf.
[20]OMCL Method - LOSARTAN Potassium LC-MS/MS Method 190321_NMBA_APCI_POS_waste´ (Shimadzu HPLC + Sciex QTrap 5500): HPLC Parameters - April 2019. https://www.edqm.eu/sites/default/files/de_lgl_losartan_method_parameters_nm-ba_lcms.pdf.
[21]孙春艳，纪颖鹤，秦昆明，等. 液相色谱-串联质谱法测定吉非替尼中4种基因毒性杂质[J].色谱, 2019, 37(12): 1297-1304.
[22]骆美玉，隽海龙. .LC-MS/MS法测定盐酸吉西他滨中磺酸酯类基因毒杂质[J]. 哈尔滨商业大学学报（自然科学版, 2018, 34(03): 285-287.
[23]FDA. FDA updates and press announcements on angiotensin II receptor blocker (ARB) recalls(valsartan,losartan,andirbesartan)[EB/OL].[2019/11/3].https://www.fda.gov/drugs/drug-safety-and-availability/fda-updates-and-press-announcements-angiotensin-ii-receptor-blocker-arb-recalls-valsartan-losartan.
[24]刘玉珍,于泓,张仁庆.离子液体的阴离子三氟乙酸根、硫氰酸根、四氟硼酸根和三氟甲磺酸根的离子对色谱-直接电导检测法分析[J]. 色谱, 2012, 30(4): 384-390.
[25]李丹，王淑君，姚慧敏， 等. 离子色谱法测定氟达拉滨中三氟甲磺酸酯类遗传毒性杂质[J].中国现代应用药学, 2019, 36(20): 2557-2560.
