腹腔栓塞治疗腹主动脉瘤（AAAs）在临床上仍然受到动脉内膜渗漏复发的限制。这些复发与内皮内衬和基质金属蛋白酶（MMPs）介导的动脉瘤进展导致的再通相关。因此，来自美国川崎生物医学创新研究所的Menekse Ermis、 Ali Khademhosseini与韩国高丽大学的Han-Jun Kim联合将一种常见的硬化剂和MMPs抑制剂—多西环素（DOX）结合到一种剪切变薄生物材料（STB）的血管栓塞水凝胶中，DOX的加入有望通过抑制MMP活性、促进内皮清除，同时防止内渗漏。研究结果表明，含有4.5% w/w硅酸盐纳米血小板和0.3%w/vDOX的STB是可注射的，与没有DOX的相比，存储模量增加两倍。与未经治疗的血液相比，STB-DOX水凝胶减少33%的凝血时间。在体外猪主动脉模型中，从水凝胶中爆发性释放的DOX在6小时后显示出硬化效应。7天后，内皮细胞上的水凝胶持续释放DOX显示MMP抑制。该水凝胶成功地阻断患者来源的腹部动脉瘤模型。多功能STB-DOX水凝胶的硬化和MMP抑制特性可能为有效栓塞血管内的动脉瘤提供很好的机会。
相关研究内容以“Injectable Shear-Thinning Hydrogels with Sclerosing and Matrix Metalloproteinase Modulatory Properties for the Treatment of Vascular Malformations”为题于2023年9月8日发表在《Advanced Functional Materials》。
图1 动脉中主动脉瘤的发展机制
基质金属蛋白酶（MMP-2和MMP- 9）是一类锌内肽酶，通过炎症反应过程中释放的因子触发AAAs中细胞外基质（ECM）的分解（图1A）。多西环素（DOX）是一种四环素抗生素，用于抑制基质金属蛋白酶和内皮剥脱。局部注射DOX可引起内皮损伤，导致局部止血，使其闭塞。因此，在血管内动脉瘤修复（EVAR）的内渗漏治疗中，通过内皮剥脱和MMP抑制，局部输送到动脉瘤部位有效缓解主动脉扩张（图1B）。
图2 STBs表征
SNs的表面电荷分布为各向异性，具有正面和负面（图2A）。为了证实DOX添加剂对水凝胶净电荷的影响，测量水凝胶的zeta电位（图2B），结果表明，SNs的表面负电荷为−25mV，而DOX的表面正电荷为+19 mV。在SNs中引入DOX导致DOX的zeta电位显著降低，表明这两个部分之间可能存在静电相互作用。所有水凝胶粘度都随着剪切速率增加而降低（图2C）。图2D显示在包含高应变（100%）和低应变（0.01%）的交替循环的时间扫描中，剪切变薄和流变恢复的影响，在较大的应变振幅下，STB-DOX 0.5%和STB-DOX 1%明显软于Gel-SN。在较大的应变振幅下，Gel-SN-DOX 0.3的断裂网络明显软于Gel-SN（图2E-G），表明更容易注射。通过扫描电镜对冻干水凝胶的微观结构特性进行表征（图2H），在没有DOX的情况下，STB凝胶的孔隙大小表现出明显的异质性，分布范围为20~150μm。当将DOX引入STB凝胶时，孔径分布变得更加均匀，主要在20~50μm范围内，这一结果表明，DOX影响STB凝胶的孔隙结构，使孔隙径分布更加均匀并变窄。
图3 STBs的止血作用和血液相容性
使用体外凝血试验检测DOX补充剂在Gel-SN平台上的止血作用（图3A、B），与未经处理的血液对照组相比，STB和STB-DOX水凝胶显著减少凝块形成的时间。采用溶血实验研究水凝胶的血液相容性。不含DOX和低剂量DOX（0.1%和0.3% w/v）的STB水凝胶显示溶血百分比低于5%的标准安全极限。而添加0.5% w/v的DOX后，溶血百分比提高到5%以上。因此，0.3% w/v DOX含量的STB-DOX水凝胶为后续优化的合适配方（图3C、D）。
图4 STBs的体外物理和生物学特性
为避免损害周围的动脉组织，随着时间的推移，监测水凝胶在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中孵育时的溶胀率（%）（图4A），结果表明，所有STB条件在前20 min内达到最大肿胀，并在研究的剩余时间内保持平衡。为了检测复合水凝胶的降解性，将STBs在37°C的PBS中孵育175小时（图4B）。在PBS中，以37°C检测STBs中DOX的释放谱（图4C），所有配方在6h内均出现爆发性释放，在72 h内持续释放，释放速率逐渐衰减。通过MMP活性对内皮细胞和巨噬细胞活性的影响和细胞毒性进行评估（图4D、E）。活死染色结果显示，当DOX浓度增加到0.5% w/v时，死细胞（红色）的数量多于活细胞（绿色）（图4F）。因此，根据释放率、细胞活力和MMP抑制结果，选择STB-DOX 0.1和0.3组进行下一步评价。
图5 可注射的STB水凝胶的基准测试图和结果
如图5A所示，采用体外台式试验检测Gel-SN-DOX水凝胶在闭塞血流中的效率，根据动脉瘤的典型大小，采用特定的设计在体外复制动脉内膜渗漏。水凝胶注射的各个阶段和腰椎动脉同时发生的血流变化如图5B所示，系统内的血流循环设置为支架插入后动脉瘤模型达到约15-20 mL min−1，对应实际动脉瘤内渗漏流量。图5C比较了不同配方的栓塞成功率。相比于其他组，STB-DOX 0.3水凝胶有更高的栓塞成功率。
图6 不同处理下HUVECs的免疫细胞化学实验
通过分析CD31、VE-钙粘蛋白、ZO-1、血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）和Von血友病因子（VWF）等蛋白的表达，深入了解STB-DOX治疗对内皮细胞功能、血管生成和止血的潜在影响（图6）。为了研究这些治疗方法对血管结构完整性的影响，使用ImageJ软件进一步定量CD31阳性细胞上VE-钙粘蛋白的表达的表达（图6Aa、Ba)。接下来研究STB-DOX处理对CD31阳性HUVECs中ZO-1表达的影响（图6Ac、Bc）。STB-DOX浓度的增加下调HUVECs中VEGFR2的表达（图6Ab、Bb），表明该信号通路受到损害。综上所述，本研究结果表明，STB-DOX治疗可能会对HUVECs中这些关键蛋白的表达和活性产生不良影响，从而影响血管的健康和功能。
图7 内皮细胞可注射消融水凝胶的体外试验
栓塞6h后固定样本，切片并染色以进行内皮覆盖（图7A）。未经处理的主动脉切片的HE染色显示内皮细胞层在动脉的管腔侧，中膜上方观察到（图7B 蓝色*）。在用HE染色的载玻片初步观察内皮细胞消融后，对这些切片进行免疫组化（图7C）。切片染色内皮标记物CD31，吞噬素染色细胞骨架，DAPI染色细胞核。在未治疗的主动脉切片中可见两层主动脉壁，内膜和中膜。通过STB-DOX配方（STB-DOX 0.1、STBDOX 0.3和STB-DOX 0.5组），观察到随着DOX浓度的增加，绿色信号逐渐减少，表明内皮层的去除。
总之，本研究提出一种使用STBs和DOX治疗腹主动脉瘤的新方法。将DOX加入到由明胶和硅酸盐纳米血小板组成的可注射物理水凝胶中，可达到内皮消融和基质金属蛋白酶抑制的双重目的，随后的缓释阶段有利于保留对基质金属蛋白酶的抑制。STB-DOX水凝胶表现出强大的力学性能，并能在生理压力下阻塞管状结构。该水凝胶还能有效地抑制基质金属蛋白酶，促进硬化作用，并在生理血压和血流速率下成功地阻断患者来源的动脉瘤囊模型。本研究还发现，STB-DOX治疗影响参与维持内皮细胞功能、血管生成和止血的几个关键蛋白的表达，包括CD31、VE-钙粘蛋白、ZO-1、VEGFR2和VWF。这些结果表明，这些可注射的的水凝胶在血管和腹主动脉瘤栓塞方面具有巨大的潜力。未来的研究可以扩大这些水凝胶在其他应用中的潜力，并优化其成分和性能以适应其他医疗条件。总的来说，这些结合DOX的可注射性水凝胶的发展代表靶向治疗血管疾病的一个有前途的进展。
文章来源：https://doi.org/10.1002/adfm.202305880
