人工重建胶原组织的纳米纤维结构是构建肌腱类似物的一种有前景的方法，该肌腱类似物具有与组织相似的生物力学特性，较高的机械强度、韧性以及耐受性，抗疲劳和抗断裂特性。近日，来自上海科技大学的凌盛杰和复旦大学江立波教授团队进行了模仿自然组织结构和力学的仿生工程纤维用于肌腱修复和再生的相关研究。研究成果以“Tendon Repair and Regeneration Using Bioinspired Fibrillation Engineering That Mimicked the Structure and Mechanics of Natural Tissue”为题于9月1日发表在《ACS Nano》上。
本研究受天然纺丝蛋白纤维启发，构建了人工肌腱（FAT）。该人造纤维肌腱具有高度有序的分子和纳米纤维结构，与软胶原组织的结构相似，具有肌腱的机械和抗断裂特性。这种相似性为研究FAT在跟腱缺损修复中的应用提供动力。体外细胞实验、细胞中肌腱相关基因表达以及肌腱损伤体内实验结果表明，FAT中高度定向的纳米纤维大大促进肌腱相关基因的表达，并促进跟腱损伤后结构和功能的恢复。这些结果为FAT在临床中的应用提供前景。
本文从以下几个方面进行详细描述
1. 模仿蚕丝纺丝工艺制作TM-FAT
2. HONF对机械性能的作用
3. HONF对TM-FAT抗断裂能力的作用
4. HONFs对大鼠BMSCs活力的作用
5. 用于跟腱缺损修复的TM-FATs
6. 解剖大体观
7. 组织染色
8. 磁共振成像评估
9. 跟腱功能指数评估
10. 肌腱相关基因表达分析
图1 蚕丝纺丝过程蚕丝纤维蛋白的结构重塑
如图所示，胶束自组装和机械负载引起纤维化是天然蚕丝纺丝的两个关键过程。蚕丝纤维素由高度重复的亲水-疏水-亲水结构域组成，其中疏水结构域和亲水结构域分别形成β-片层结构和无规螺旋结构。在疏水作用力的驱动下和亲水丝胶蛋白的帮助下，蚕丝蛋白在蚕丝腺中聚集成直径100-200 nm的无定形胶束或胶束聚集体（称为纤维蛋白球）。在纺丝过程中受到物理剪切或拉伸时，胶束和球会变形为纳米纤维丝，并沿着剪切的方向定向，随后水逐渐从胶束中释放出来。机械拉伸引起的纤维化过程会在分子链之间，特别是在β片层之间迅速形成分子间氢键，强烈的疏水作用会使其具有一定的聚合趋势。
图2 制造TM-FAT的仿生策略
受天然蚕丝纺丝过程中胶束自组装和机械负载诱导纤维化协同作用的启发，本文构思了一种将相变诱导胶束化和机械负载驱动纤维化结合起来，构建FAT中的肌腱模拟HONFs。实验选择再生蚕丝纤维蛋白（RSF）作为起始材料。RSF保持原蚕丝蛋白独特的亲水-疏水-亲水序列，具有胶束化能力。此外，RSF是一种广泛存在的天然蛋白质，由于其出色的生物相容性、良好的免疫原性和可调的体内降解性，是组织工程和再生医学领域众多生物材料应用的理想材料。具体来讲，研究人员使用RSF/聚环氧乙烷（PEO）/Ca2+离子溶液来模拟蚕丝的天然纺丝过程，亲水性PEO可被视为丝胶蛋白的替代品。在此过程中，大多数RSF分子都聚集成胶束和胶束聚集体。PEO与特定数量的RSF结合形成了连续均匀的基质。可通过调节PEO的含量来调整球状物的大小，进一步影响ACM的机械性能。在本研究中，选择的RSF/PEO比率为80%，与天然纺丝溶液中丝纤维素和丝胶蛋白的比率非常相似。
图3 TM-FAT的机械性能
接着研究人员对TM-FAT、NF-AT和ACM进行平面拉伸试验，确定HONF对TM-FAT机械性能的影响。干燥状态下的ACM很脆，而TM-FAT在刚度、强度、伸展性和韧性之间保持了良好的平衡。与对照材料相比，TM-FAT在高水合状态下也保持机械性能上的优势。TM-FAT在平衡韧性和模量方面的优势也非常明显。将TM-FAT的机械性能与其他生物和工程材料系统进行比较，脱水TM-FAT的强度和刚度与典型肌腱组织的强度和刚度非常匹配，突显其在肌腱修复和再生应用中的适用性。。对于TM-FAT而言，肌腱动态力学和断裂力学的匹配更为重要，因为它需要在日常使用中承受瞬时和持续的循环机械刺激，并在长期植入过程中保持结构和机械稳定性。结果显示TM-FAT值均比现有韧性水凝胶的测量值大3倍左右。比单网络水凝胶的疲劳阈值高10-100倍。此外，应力-应变曲线清楚地表明，在拉伸断裂过程中，TM-FAT形成了合适的阶梯状韧性断裂，而不是瞬间的全部断裂。应力曲线上的每个阶梯都与裂纹的纵向转移相对应，大大增加了裂纹扩展的路径，显著提高了TM-FAT的断裂韧性。阶梯状延展断裂对有缺陷的肌腱至关重要，可防止在受到瞬时机械力时发生瞬间断裂。
图4 对移植后大鼠跟腱恢复情况进行分析
术后八周，对TM-FAT进行HE染色显示出正常的肌腱样结构，其中有平行纤维、致密的细胞外基质、伸长的腱母细胞和腱细胞，与自体组织组非常相似。TM-FAT中的细胞和新生组织呈定向生长。相比之下，NF-AT组的细胞更圆，有炎症细胞浸润，细胞外基质较少，表明其肌腱再生能力有限。MT染色显示，植入TM-FAT 8周后，样本成熟胶原纤维多于NF-AT组。用阿尔新蓝染色法测量再生跟腱中肥大软骨细胞的增殖情况。与NF-AT组和缺损组相比，TM-FAT组和自体组有较少的肥大软骨细胞，可能是由于TM-FAT中HONFs的作用。平行纤维结构有利于跟腱的形成，而无定向结构则倾向于促进软骨细胞增殖和成骨。在TM-FATs组中，正常跟腱区域所占总面积的百分比远高于NF-ATs组，接近自体修复组。核磁共振成像评估结果示：正常肌腱组的腓肠肌内侧和外侧肌腱以及屈指浅肌腱均呈均匀的低信号，边缘相对清晰。手术后，所有组的肌腱都出现炎症反应，表现为中高密度的不均匀信号。然而，在TM-FAT组中，信号不均匀的区域在4周后有所减少，8周后仅在缝线末端残留少量。接着使用跟腱功能指数进行运动能力恢复评估，结果显示缺损组大鼠的运动能力低于其他手术组。在TM-FAT、NF-AT和自体组中观察到跟腱功能随时间而增加，在所有观察期内，TM-FAT组的恢复能力都明显优于NF-AT组。
总结与展望
本文受天然纺丝过程的启发，提出了一种利用相变诱导胶束化和机械负载诱导纤维化协同生产TM-FAT的策略。由此制得的TM-FAT具有高度各向异性。这种良好的结构赋予TM-FAT与天然肌腱相匹配的机械力和抗断裂特性。该相似性表明，TM-FAT是一种有前途的跟腱修复和再生植入物。与NF-AT相比，TM-FAT的纤维结构和高取向性分别通过改变细胞粘附性增加跟腱相关基因的表达和跟腱相关功能的恢复。在动物运动、组织学特征、基因表达和免疫反应方面，植入TM-FAT刺激肌腱修复和再生的程度接近自体组。以上结果激励我们继续利用该策略开展损伤后体内组织替代研究，从而为TM-FAT的临床应用铺平道路。
文章来源：https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsnano.3c03428
