本文旨在对线性验证的相关系数与截距不符合要求的原因进行分析。
一、概述
在做线性相关验证时，相关系数与截距是最该验证项非常重要的两个参数，笔者在多年的从业经历中多次碰到或见到相关系数与截距不符合要求的情况，导致这种情况的原因多种多样，遂将笔者总结的一些原因与读者分享，且敬请方家指正。
需要说明的是，鉴于篇幅有限，本文仅论述HPLC且为紫外检测器条件下的线性验证情况，其他情况可以参考相关内容；且仅分析技术上的原因，仪器故障与操作失误这两个原因可以导致所有的异常结果，不在本文讨论。
二、 朗伯比尔定理
众所周知，组分的紫外吸收遵循朗伯比尔定理，其物理意义是当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比，而与透光度T成反相关。也就是说，在理想状态下响应值与浓度在一定范围内应该是一条经过原点的直线，相关系数应该是1，截距为0；但是现实总会在一定程度上偏离理想状态，这种偏离就会导致相关系数不再是1，截距不再是0。
偏离的原因多种多样，程度也各有不同，本文仅分析由实验设计不当导致的偏离，即分析人员可以纠正过来的偏离，对于某些仪器原理或性能等方面不能纠正的偏离，本文不作论述。下文详细论述各种可能导致线性异常的原因。
三、 线性验证异常原因
误差
实验过程中的误差是线性验证的结果偏离理想状体的一个重要原因，误差越大，意味着某个变量的响应偏离预期值越大，在线性验证的结果中就体现出得到一个糟糕的相关系数与截距的值。
实验过程的误差主要来源于两个方面：操作过程的误差与仪器响应的误差。
1、操作过程的误差
操作过程引入较大误差常见不适宜的做法有：从贮备液稀释不同浓度线性溶液时，取样体积过小；如体积为0.8ml、0.9 ml 、1 ml、1.1 ml与1.2ml等；小的取样体积必然引入较大的误差，即实际浓度偏离计算浓度较大，导致线性相关数据偏离较大。这一类操作误差一般为随机误差，它在线性数据一般表现为下图的形式：
为减少操作误差，由贮备液稀释线性溶液时，取样体积应尽可能大；如含量测定线性验证，建议取样体积应不小于10ml，量瓶体积应不小于100ml；杂质线性验证也应充分评估操作过程引入的误差对验证结果的影响。
2、仪器响应的误差
仪器响应误差越大，线性越差，这个现象众所周知；GC的响应误差一般大于LC，所以GC的线性验证数据一般较LC为差。导致仪器响应误差的原因多种多样，仪器原理或性能等方面不能纠正的情况本章节不予讨论，仅论述方法或实验设计等方面的原因。常见的导致仪器响应较大误差的原因一般有波长选择不合理、流动相pH值选择不合理、色谱峰拖尾与进样体积过小等。
2.1 检测波长选择不合理
如方法检测波长不是组分实际上的最大吸收波长，则仪器响应误差较大。导致该情况的原因常见于采用紫外分光光度计获得组分光谱图，所选稀释剂不同于流动相；该情况下即组分在HPLC系统中的最大吸收波长与检测波长不一致。
2.2 流动相pH值选择不合理
许多时候组分电离状态与未电离状态的响应值有明显不同，如流动相pH值不在组分的pka±2范围外，且流动相缓冲能力不足，分析过程中组分电离状态变化较大，导致响应值差异较大；
2.3 色谱峰拖尾
色谱峰拖尾导致积分不准确，响应值的误差较大。
仪器响应的误差一般也都是随机误差，其线性表现形式同操作误差。
3、溶液未分散均匀
某些组分在稀释剂中分散需要一段时间，如果振摇澄清后立即将溶液倒入进样小瓶，很可能由于溶液尚未分散均匀导致进样小瓶中的浓度与溶液平均浓度不一致。
四、线性验证异常原因
流动相本底吸收大
如流动相本底吸收大，即检测波长低于或接近流动相的截止波长，流动相有较大的吸收，可能会对线性产生一定程度的影响。尤其在杂质的线性验证中，这种影响非常明显。最常见的表现形式是低浓度下的响应值与高浓度不成相应的比例，即浓度为一半的溶液响应值远小于高浓度响应值的一半。一般来说，如果流动相本底吸收大，截距一般为负值，且回收率验证中低浓度样品回收率较低，高浓度样品回收率较高；其线性表现形式一般如下图：
五、线性验证异常原因
溶液未分散均匀
某些组分在稀释剂中分散需要一段时间，如果振摇澄清后立即将溶液倒入进样小瓶，很可能由于溶液尚未分散均匀导致进样小瓶中的浓度与溶液平均浓度不一致。如果没有研究溶液分散均匀所需时间，可能某个浓度点的进样小瓶溶液浓度与计算浓度差异较大，导致线性数据异常，其表现形式一般为下图：
六、线性验证异常原因
交叉污染
此处论述的不是引入外源的污染，这是操作失误，不属于本文论述的范畴。这里的交叉污染指的是杂质对照品不纯含有另外一种需要研究的杂质，如杂质A中含有10%杂质B，如果配制混合线性溶液，杂质A中含有的杂质B必然影响杂质B的线性结果。这种情况下，杂质A与杂质B应当分别验证，不宜配制混合线性溶液。
七、其它
由上文可知，导致线性验证数据异常原因主要来源于方法设计与操作两个方面，如想获得良好的线性验证数据，在方法开发与设计阶段应当充分评估方法各项参数对线性验证的风险，在验证过程中应当充分评估各个操作过程对结果的影响。
