摘要
近年来，益生菌类微生态制剂发展迅速，为保证行业正常发展，使益生菌制剂安全有效地为人类健康服务，我国对益生菌制剂的质量标准问题日益关注。益生菌的质量标准是组织益生菌生产和提高产品质量的重要手段，《中华人民共和国药典》是国家对益生菌制剂实行监督的准绳，也是国家对益生菌制剂生产和质量的要求，与其他药品种类相比，益生菌等微生态制剂的标准还存在不少差距。2018 年，我国已形成近千亿元的益生菌产业及庞大的市场。但在益生菌产业快速发展的过程中，存在益生菌概念使用不当、核心菌株模糊不清、功能性质难以界定等诸多问题，致使益生菌的健康发展存在潜在的隐患和风险。
本文对我国微生态制剂的现状进行了分析，从品种概况、产品作用机制、标准现状、循证医学及临床风险等多角度出发，对现有益生菌制剂的质量标准体系存在的风险不足加以分析，希望能够促进相关标准的提高并对行业健康发展有所助益。
关键词
微生态制剂; 益生菌; 质量标准; 循证医学; 肠道微生物
人体肠道是一个庞大复杂的微生态系统，包括400 ～ 500 种菌种［1］，大约有 1014个微生物［2］。肠道微生物的种群构成及数量比例维持着动态平衡，并通过宿主与微生物之间、微生物与微生物之间的相互作用以及营养分配和物质转化调控实现。肠道微生物对稳定宿主的生理状态和抵抗致病菌侵袭具有极其重要的作用。患病宿主肠道菌群的定殖模式、菌群组成、数量、优势菌群等均发生显著变化［3］。
微生态制剂( microecological preparation) 是根据微生态学原理，利用对宿主有益的正常微生物或其促进物质制备成的制剂，具有维持或调整宿主肠道微生态平衡、防治疾病和促进宿主健康的作用。随着微生态学研究的深入，其应用也越来越广泛。与化学药物不同，微生态制剂的作用具有明显的菌株特异性和剂量依赖性［4］。
2018 年，我国已形成近千亿元的益生菌产业及庞大的市场。但在产业发展过程中，存在着概念使用不当、核心菌株不明、功能性质难界定等诸多问题，致使益生菌的发展存在潜在的隐患和风险。近年来，为保证行业正常发展，使益生菌为主的微生态制剂安全有效地为人类健康服务，我国对益生菌制剂的开发及质量标准问题日益关注。与其他药品种类相比，益生菌等微生态制剂的质量标准存在较大差距。基于此，本文将重点针对益生菌为主的我国微生态制剂现状进行综述，并对现有益生菌制剂质量标准体系存在的风险不足加以分析，希望能够促进相关标准的提高并对行业健康发展有所助益。
1、微生态制剂概述
微生态制剂可分为益生菌( probiotic) ［5］、益生元( prebiotic) 和合生元( synbioltic) 3 种［6］。作为目前我国最主要的临床微生态制剂，益生菌的使用可以追溯到发现微生物之前的历史阶段。
现代益生菌研究的重点是筛选潜在的益生菌菌株并确定其作用机制，以进一步了解菌群的复杂相互作用及其定殖抗性( 抵抗病原菌入侵的能力) ［7］。益生菌研究的迅猛发展从益生菌相关研究成果数量增加上有所反映( 从 2000 年的 176 篇·年 － 1增加到2014 年的 1 476 篇·年 － 1) 。大量的益生菌临床试验学术成果使医疗机构和公众难以确定益生菌与相关疾病的对应关系。随着用于检测不可培养微生物的新型技术的出现( 75% ～ 95% 的结肠微生物无法在标准培养基中生长) ，人们对微生态学有了更好的了解和认识［8 － 9］。这些新的技术使研究人员能够专注于抗生素或慢性疾病等破坏性因素如何改变微生物群落，以及各种益生菌菌株如何纠正或恢复这种平衡［10］。
2001 年，联合国粮食及农业组织( Food and Agriculture Organization，FAO) 对益生菌进行了重新定义:“益生菌是指那些当使用剂量适量时会对宿主产生健康影响的活体微生物”［11］。2013 年，世界胃肠病学组织( World Gastroenterology Organisation，WGO) 发布了有关益生菌和益生元的全球指南，并确认益生菌的功效具有菌株特异性和剂量特异性［12］。2014年，欧美益生菌行业共识声明回顾了益生菌的发展，并将临床益生菌分为安全微生物、膳食补充剂以及益生菌药物等 3 大类。
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2、微生态制剂作用机制
2． 1 肠道微生物
人体肠道中含有超过 40 万亿的细菌细胞，除细菌外，还包括极少的古生菌、真菌、原生生物以及大量病毒和噬菌体，这些微生物给宿主带来近 60 万个肠道微生物基因［12］。在菌种及菌株水平上，宿主微生物群落多样性是显著的，这种多样性是由宿主基因型、宿主出生时通过垂直传播途径获得的初始定殖微生物群落和宿主饮食习惯共同决定的。正常情况下，肠道菌群与宿主之间是共生关系，许多研究显示，健康人群与患者的定殖微生物群落显著不同，尽管如此，目前仍不能准确表述健康宿主微生物群落的构成特点。因此，当前益生菌研究的热点是探索菌群能否促进健康或逆转疾病状态［12］。
2． 2 临床作用机制
益生菌类微生态活菌制剂在临床使用中预防或治疗疾病的作用机制主要包括以下几个方面［13 － 15］。
2． 2． 1 维持肠道菌群平衡
当机体受到不利因素影响时，菌群间的动态平衡被破坏，导致胃肠道内的需氧菌和厌氧菌比例失衡，此时添加适当的益生菌可以调节菌群比例，对宿主胃肠道功能起调节作用，恢复菌群平衡。
2． 2． 2 生物夺氧理论
当机体处于低氧状态时，体内需氧菌的繁殖受到抑制，厌氧菌在体内定殖生长，病原微生物的繁殖受到抑制，机体状况良好。当机体处于富氧状态时，体内需氧菌大量繁殖，通过吸收利用肠道内的氧促进局部氧分子浓度降低，有利于机体内的厌氧菌例如双歧杆菌的生长繁殖，从而使机体微生态恢复到平衡状态。
2． 2． 3 生物拮抗作用
益生菌与肠道内的有益菌群共同拮抗病原微生物，占据肠道的吸附位点，在肠道内定殖，病原微生物没有吸附位点，无法定殖发挥作用而被机体排出，从而促进有益菌群的优势种群作用，肠道微生态恢复平衡。
2． 2． 4 合成有益代谢物
益生菌在生长繁殖过程中产生的有机酸能够促进胃肠道 pH 值降低，形成低酸环境，抑制致病菌的生长繁殖，同时，有机酸对消化液的分泌起促进作用，机体的消化功能得到增强，从而进一步加强机体对营养物质的消化吸收功能，恢复肠道功能。
2． 2． 5 增强机体免疫力
益生菌的细胞壁含有免疫多糖类物质，刺激机体产生干扰素，增强巨噬细胞的活性，调节免疫系统，诱导保护性细胞因子( 如IL-10 和 TGF-β 等) 并抑制炎症因子( 如 TNF-α) ，增强机体的免疫能力，改善机体的免疫水平［12］。
3、药用益生菌产品现状
3． 1 主要产品分类
目前国内用于生产药用益生菌的微生物约有20 余种，绝大多数菌株与国外不同。这些微生物按菌株来源和作用方式可分为原籍菌、共生菌和真菌［16］。原籍菌来源于人体肠道菌群，可直接补充原籍菌，如双歧杆菌、乳杆菌、粪链球菌等; 共生菌来源于人体肠道菌群外，与人体原籍菌共生并促进原籍菌生长、繁殖或直接发挥作用，如芽孢杆菌、酪酸梭菌、枯草杆菌等; 真菌制剂主要为布拉酵母菌，作用机制独特。另外，按菌株的生存条件可分为厌氧菌( 双歧杆菌、乳酸杆菌、梭状芽孢杆菌等) 、兼性厌氧菌( 大肠杆菌、肠球菌、地衣芽孢杆菌等) 和需氧菌( 枯草芽孢杆菌等) ［15］。
3． 2 《中华人民共和国药典》收录品种
《中华人民共和国药典》2015 年版的微生态活菌制品总论中共收录 22 种批准上市的微生态制剂，大多数用于预防和治疗胃肠道疾病。所采用的菌种主要包括: 保加利亚乳杆菌( Lactobacillus bulgaricus)等 15 种［17］。我国现有药用益生菌产品以 OTC 药品为主，部分为双跨品种［15］。
3． 3 国外益生菌制剂情况
3． 3． 1 美国
益生菌仅作为膳食补充剂、功能性食品、医疗食品和非处方药品，产品上市前需通过安全认证认可( generally recognized as safe，GRAS) ，通过GRAS 后上市前无需 FDA 批准，不能有临床应用导向，暂无上市的益生菌药品［18］。
3． 3． 2 日本
1990 年确立了特殊健康食品管理级别，由于保健成本上升等因素，日本撤销了部分OTC 类益生菌药品以降低医疗保险费用，但是有完善安全记录的此类药品可以作为准药物或功能性保健食品进入市场。
3． 3． 3 欧洲
各国均有益生菌功能性食品的管理标准。挪威食品科学安全委员会于 2009 年出台了病患应用益生菌制剂的评价法规，严格规定益生菌制剂不允许用于处于疾病临界状态的患者。荷兰和瑞典专门为含益生菌特定产品的健康声明建立了可追溯的科学档案。澳大利亚和新西兰将益生菌产品列入非传统食品范畴中的新型食品，需要对其进行公共健康和安全性评价［15］。
4、用益生菌质量标准现状
4． 1 国内标准
我国批准上市的微生态活菌制品涉及中药、化学药品、保健药品和生物制品 4 类，共计 50 个品类、95 个文号。《中华人民共和国药典》2015 年版三部微生态活菌制品总论共收载 22 个品种，15 种微生物。分类为生物制品的微生态活菌制剂执行《中华人民共和国药典》2015 年版三部要求，在菌种管理、菌种鉴定、含量测定、杂菌检查方面的标准较为全面［19］。分类为保健药品、中药和化学药的微生态活菌制品标准大多为地标转国标或者新药转正标准，标准来源不明，年代较早，对生产管理控制和检定方法的要求都很滞后。
由于标准体系不一致，导致相同产品质量水平存在较大差异，相同品种的菌株来源也不尽相同。菌种是微生态活菌制剂的核心，菌种的稳定性和纯度决定了微生态活菌制剂的药效和安全性，现行地标转国标或者新药转正标准在菌种鉴定方面存在极大隐患。
4． 2 国外标准
美国药典 USP43-NF38 中收录的通则〈64〉益生菌中，除活菌计数、污染检查等常规项目外，还包含特征鉴定项，采用的方法是 PCR 法。目前该通则仅包含乳酸菌和双歧杆菌两大类微生物的 PCR 特征鉴定，根据其说明，其他菌种的特征鉴定将陆续加入该通则。相比于《中华人民共和国药典》2015 年版，USP43-NF38 加入了 PCR 等分子生物学方法，实现了更加严格的益生菌菌种控制。欧洲药典 EP 10． 0 益生菌部分的特征鉴定采用宏观法、微观法、生化测试法以及分子遗传学、高通量测序等方法完成，最终实现菌种到株水平的鉴定。由于欧洲药典并没有严格控制方法来源，这为特殊产品菌种鉴定方法的使用提供了便利。无疑，欧洲药典在菌种控制及稳定方面相较美国药典 USP43-NF38 和《中华人民共和国药典》2015 年版更为严格。
4． 3 质量标准不足与缺陷
菌种和菌株是微生态制剂的核心，以国务院《病原微生物实验室生物安全管理条例》［20］为基础，参考《人间传染的病原微生物名录》的分类原则，按照对人体危害程度可将菌种分为 4 类［19］。《中华人民共和国药典》2015 年版收录的微生态活菌制剂中，肠球菌等条件致病菌与芽胞类活菌制剂的生产菌株为第 3 类，具有条件致病性，存在一定风险; 其他活菌制剂菌种为第 4 类，通常情况下认为安全可用［21］。
影响药用益生菌发挥功效的因素有很多，包括制剂的制备方法、贮藏条件、菌种配伍方式、肠道菌群状态、使用剂量和方法、宿主个体差异、菌群存活率等。开发合格有效的益生菌临床制剂应综合考虑以下 3 类影响因素: ① 菌株因素: 菌株必须保证无毒、无害、无不良反应，菌株必须具有传代稳定性，菌株需具有耐受胃酸、胆汁酸等定殖环境因素的能力，菌株必须具有黏附性，产乳酸菌株要有较强的抗胃酸能力及产生抗菌活性物质的能力等。② 宿主因素: 宿主肠道内的微生物菌群对制剂在宿主肠道中发挥作用具有多方面的影响。通常宿主肠道的正常菌群对外来菌群具有强烈的定殖抗性，作为非宿主原有正常菌群成员的益生菌类微生态制剂很难在宿主肠道中黏附定殖。如果宿主处于菌群失调状态，制剂就很容易发挥其作用，效果更加明显。③ 其他因素: 生产工艺条件对制剂发挥功效具有很大影响，如菌株在发酵时的生长条件以及发酵结束的时间等都会影响菌体的存活率。同一初始菌株，由于发酵条件不同，其终端代谢产物不同，作为制剂的作用效果也会有很大不同。另外，产品剂型及发酵技术也会影响产品的功效。
目前对药用益生菌的菌株选择、配伍、安全性、有效性和使用规范等方面都还没有相对统一的技术标准和指导原则，一方面是因为理论研究落后于实际应用，即使是应用历史很长的益生菌类微生态制剂，其作用机理仍然不完全清楚; 另一方面是由于必要的技术方法不完善，相关临床证据及试验数据不足等。作为临床用药，现有大多数市售益生菌制剂并没有充分的临床试验证实其安全性、有效性和处方合理性等关键属性，对于如何正确评价益生菌类微生态制剂的作用效果还需要进行深入的研究。
5、循证医学分析及临床风险
5． 1 循证医学证据及等级
循证医学( evidence-based medicine，EBM) 又称实证医学，其核心思想是医疗决策( 即患者的处理、治疗指南和医疗政策的制定等) 应在现有最好的临床研究依据基础上作出，同时也重视结合个人的临床经验。传统医学以经验医学为主，即根据非实验性的临床经验、临床资料和对疾病基础知识的理解来诊治患者。循证医学并非要取代临床技能、临床经验、临床资料和医学专业知识，它只是强调任何医疗决策应建立在最佳科学研究证据基础上［22］。临床研究依据按其科学性和可靠程度大体可分为 4 ～5 级［23］。
目前，大多数国内药用益生菌产品在上市前均没有循证医学数据报告( 表 1) 。对涉及益生菌的循证数据进行了统计研究。
5． 2 临床风险分析
抗生素应用导致的微生物群落失衡在很大程度上推动了益生菌的临床治疗应用［24］。在未提及诸如处方、功效和安全性等参数的情况下，大多数益生菌制剂没有经过严格的临床试验。宽松的标准导致在不同的国家和地区出现大量未经临床循证证实的益生菌制剂。直到近年，多个国家出现的益生菌制剂问题才使益生菌的安全性特征与高风险人群的相关性等问题引起足够的关注。
尽管许多研究都认为益生菌对健康具有显著的促进作用，但实际上，除了特定菌株明确具有循证医学证据证明其具有促进健康的作用，大多数益生菌及其制剂的情况要复杂得多。除益生菌所含菌种的剂量和功效外［25］，还必须全面研究宿主的免疫反应才能更好地了解和使用益生菌。目前的普遍观点认为益生菌是绝对安全且有效的，这是一个值得担忧的问题。
FAO 和 WHO 联合评估益生菌指南报告［11］指出益生菌的 4 种特定类型不良反应包括益生菌给药引起的微生物易位感染［26 － 29］、部分益生菌代谢产物引起敏感人群产生的代谢紊乱及过敏反应［30 － 32］、易感个体过度免疫刺激引起的瘙痒性湿疹等［33 － 35］以及毒性基因及耐药基因转移导致的其他不良反应［36 － 38］。尽管支持益生菌安全性的研究远远超过了其风险的相关研究，但显然并未反映出益生菌安全性的整体情况。
6、质量标准制修订建议
6． 1 益生菌制剂共识
益生菌的核心特征是足够数量、活菌状态以及有益健康功能。2014 年，由国际益生菌与益生元科学联合会( ISAPP) 发布的关于益生菌的共识中也突出强调了益生菌的这 3 个核心特征。益生菌的定义也得到了欧洲食品与饲料菌种协会( EFFCA) 、加拿大卫生部( Health Canada) 、世界胃肠病学组织( WGO) 和欧洲食品安全局( EFSA) 等相关组织和机构的认可。益生菌的功效发挥应以活菌为先决条件。益生菌的功能应建立在科学严谨的临床试验评价和循证医学证据基础上，体外实验与人体完全不同，其结果不能全面反映益生菌的作用，动物实验可以作为参考，但需要更深入全面的人体或临床试验予以确认［39］。
研究人员发现益生菌的定殖抑制了胃肠道固有微生物菌群和肠道基因恢复到正常状态。益生菌胃肠道的成功定殖与否将决定其是否会影响其人体固有微生物以及肠道基因表达情况。然而研究发现，大部分健康志愿者的胃肠道会抵抗益生菌的定殖，这提示益生菌补充剂并不适用于所有人，在抗生素使用后服用益生菌有潜在的不良反应，甚至可能带来长期的不良后果。目前使用的一刀切的益生菌制剂和治疗范例应该被一种结合科学、测量和技术的定制疗法所取代［40 － 41］。
6． 2 益生菌制剂风险
不同国家在药品安全方面持有不同政策。无论采取何种政策，益生菌高危人群始终存在与使用益生菌有关的风险［42 － 43］。益生菌的配方、剂量和管理模式的变化可能会极大地影响宿主的预防及治疗效果［44］。通常从土壤等生态位中筛选出的潜在益生菌与人类肠道内源性生态位显著不同，使用后，肠道微环境和免疫因子可能会对益生菌菌株施加选择压力并激活潜在的毒力因子［45 － 46］。在生产中，益生菌经常与海藻酸钠混合并在氯化钙溶液中塑形［47］，因此，应预防胶囊激发宿主的免疫系统以及制剂辅料触发相关酶活性等导致的健康风险。另外，应严格监管益生菌的制造、标记和配送［48 － 49］。
在大量报道益生菌积极效果时，其负面影响已被完全忽略。例如，益生菌大肠杆菌 NISSLE 1917可能会缓解慢性炎症性肠病和结肠炎，然而，该菌株还可以通过肽聚酮化合物的修饰和宿主细胞因子的调控诱导遗传毒性［50］。该研究表明，与其他药物一样，即使证明功效明显的益生菌也可能具有不良反应，“宿主微环境”是决定益生菌致病性或条件致病性的重要条件。
6． 3 理想益生菌特性
综合考虑，理想益生菌制剂应具有的特性应至少包含以下 5 点: ① 可在目标器官或组织( 包括肠道、皮肤表面、口腔、阴道或尿道等) 中存活。② 与宿主系统相互作用。③ 具有抗病或健康促进作用。④ 宿主安全性风险低。⑤ 制造及使用的便利性等［51］。一般情况下，益生菌菌株不应受到与益生菌同时服用的药物或抗生素的影响。例如，由于仅受抗真菌药物的影响，而不受抗生素的影响，含布尔酵母( Saccharomyces boulardii) 类益生菌可以与口服抗生素同时服用［35］。益生菌还应具有良好的安全性档案，应证明益生菌缺乏从靶器官转移的能力，没有致病机理，并且几乎不会引起严重的不良反应。另外，还需要证明包括生产复杂程度、菌株批次稳定性、长期稳定性和其他常见的存储条件稳定性等信息。
6． 4 质量标准制修订的重点
确定一个合格的益生菌制剂所应具备的质量标准是推动益生菌研制和发展的极其重要的方面［51］。综合以上分析，新时期益生菌类微生态制剂的质量标准应至少包含并不限于以下内容。
6． 4． 1 菌种鉴定
市售益生菌类微生态制剂多数为野生菌株或经驯化培育的菌株，在传代过程中会发生变异甚至出现耐药性［52］。用于生产的菌种应标明所用菌种的属、种、菌株及菌号等详细信息，同时还应具有国家有关部门的菌种鉴定书。
6． 4． 2 菌种安全
目前益生菌大多缺乏科学的分子生物学检查及鉴定，应在标准中适当考虑采用分子生物学的方法研究菌株遗传背景，确定基因组中是否具有耐药及毒力因子基因的存在［53］，并建立快速筛查方法确保菌株的安全性和传代稳定性［54］。
6． 4． 3 活菌数量
活菌数量是评价产品质量的关键指标。目前对益生菌类微生态制剂活菌的检测多采用培养计数法，应考虑菌种的靶器官环境因素等，通过建立合理的体外模型，更加有效地研究菌种在目的环境中的存活率、稳定性等。
6． 4． 4 菌种配伍
在早期的产品开发过程中并没有关注菌种的配伍关系及分子层面的相互作用关系，由于多菌种益生菌制剂配方的特殊性，在菌株层面单独开展研究并不能说明关于整体配方的任何问题，故而每个复合配方都应在配方层面进行整体性研究。肠球菌属微生物致病性、耐药较强，且可传播耐药性，故含肠球菌菌株的益生菌药物更应引起业界重视，FAO/WHO 已建议益生菌中不宜使用肠球菌［19，55 － 56］。
6． 4． 5 剂型选择
外源性微生物能否在肠道黏附后定殖，应作为其效果的重要指标。给药途径和剂型等因素对此影响极大，到达靶器官的微生物数量和活性均会被严苛的体内条件影响，因此，益生菌标准应关注合理的给药途径，开发新的剂型和使用方法［52，55 － 56］。
我国微生态学还处于发展阶段，微生态制剂自然也处于不很完善的“初级阶段”。活菌的种类及其数量是益生菌类微生态制剂的灵魂，与其从外界补入数量不大、不能定殖的非原籍菌，不如创造条件去促进原籍益生菌迅速生长繁殖，以促进微生态平衡［57］。另外，应该尽快完善法规标准，规范医药类益生菌的研制、生产、营销、宣传和使用行为，通过严格执法保证行业的健康发展。
