摘 要
本文将对自身对照法的原理及应用进行详细的讨论，并重点分析其中存在的无法避免的系统误差以及由于该系统误差导致的不适用情况。
1、概述
自身对照法是一种常见的杂质含量计算方法，测定杂质含量时，将供试品溶液按一定的稀释倍数稀释作为对照溶液，稀释倍数一般为100倍、500倍、1000倍等。中国药典收载的质量标准正文中有关物质的杂质含量计算方法绝大多数是自身对照法。自身对照法一般可分为加校正因子的自身对照法与不加校正因子的自身对照法。加校正因子的自身对照法适用于已知杂质（校正因子在0.2-5之间）的计算，不加校正因子的自身对照法适用于响应与主成分接近（国内要求校正因子在0.9-1.1之间，欧美要求0.8-1.2）的已知杂质与未知杂质的含量计算。
2、自身对照法的系统误差分析
自身对照法在计算杂质含量时，存在两个无法避免的系统误差：流动相本底吸收；供试品杂质含量。
（1）流动相本底吸收
流动相的本地吸收将影响自身对照法的计算结果，且为系统误差，非随机误差。假设待测杂质与主成分响应一致，流动相本底吸收为n，对照溶液主成分吸收为a，待测杂质吸收为A,稀释倍数为k，待测杂质的真实含量为A/ka，而自身对照法计算的杂质含量为（A-n）/ka（a-n）。计算结果减去真实结果的差值为（A-a）n/ka（a-n），由于对照溶液主成分的吸收a一定大于流动相本底吸收n，否则该方法不适用；因此由该公式可看出，当A=a时，计算结果与真实结果一致；当A＞a时，即对照溶液主成分浓度小于待测杂质浓度时，差值为正值，计算结果大于真实结果；当A＜a时，计算结果小于真实结果。
计算结果不得小于真实结果，因此对照溶液主成分浓度不得大于待测杂质浓度，由此可得出对照溶液浓度不得超过待测杂质限度浓度的结论。从这个角度看，如杂质限度为0.1%，则对照溶液应为供试品稀释1000倍，不应使用1%自身对照溶液。
从以上讨论也可推测，自身对照法计算回收率时，回收率应与浓度呈正相关，流动相本底吸收较大的情况下，低浓度如定量限回收率偏低的风险较大。
该误差虽不能完全消除，但可通过优化色谱条件较少，即检测波长如远大于流动相的截止波长，且待测组分的响应较强，流动相本底吸收可忽略不计，为了操作便利，在回收率符合要求的前提下，对照溶液可选择1%供试品溶液。
（2）供试品杂质含量
假设一种极端情况，所有的杂质与主成分响应一致，供试品中含有50%的杂质，则杂质响应与主成分一致，通过自身对照法计算的杂质含量为100%。这个结果可以说非常荒谬，但是阐述了一个显然的事实，自身对照法由于供试品中杂质的存在，使得检测结果高于真实值，如杂质含量高到一定程度，检测结果将偏高到无法接受。
假设所有的杂质与主成分响应一致，总杂含量为s，总峰面积为A，则自身对照法计算的总杂含量为As/A（1-s），减去真实总杂含量s，差值为s×s/（1-s），由差值公式可看出，当总杂含量s无限趋近于0时，自身对照法的计算结果与真实值一致；总杂真实值最大值为1，当总杂含量无限趋近于1时，自身对照法的计算结果为无穷大。
由以上分析可看出，当杂质含量较高时，无法忽略自身对照法的系统误差带来的计算结果偏大的影响。如计算降解试验的质量守恒，如主成分降解超过20%，采用自身对照计算，总杂含量将偏大4%，这很可能导致质量守恒验算不符合要求。笔者认为，对于杂质含量较大的供试品，如总杂超过5%，不建议使用自身对照法计算杂质含量，此处的总杂是广义上的总杂，包括残留溶剂、水分、有关物质等；该情况下可采用主成分外标法或者面积归一化法。
3、后述
自身对照法具有不用使用对照品，在样品较少的情况下操作便利的优点，但是对于多个样品，制备对照溶液较为繁琐，不如主成分外标法方便；且其存在不能克服的系统误差，因此笔者建议同仁们多尝试使用主成分外标法计算杂质含量。
