摘要
本文阐述了通过对系统适用性试验相关参数进行风险评估，设计科学合理的HPLC系统适用性试验。
一、概述
分析方法可以结构化地分解为限度、样品处理、试验参数、计算方法、系统适用性试验五个组成部分，对于HPLC分析方法，系统适用性试验是一个非常重要的组成部分，它可以用于评价仪器的灵敏度、进样重复性或特定组份的分离度是否符合要求，以保证分析方法能够顺利执行。如何设计HPLC分析方法系统适用性试验，是一个值得深入探讨的问题。
二、什么是系统适用性试验？
根据《中国药典》2020年版四部0512中关于系统适用性试验的内容为：“色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性等五个参数。按各品种正文项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，以符合要求。”没有说明系统适用性试验的概念，本人结合以上内容与自身的理解，对系统适用性试验做出以下定义：“用规定的方法进行测试，以确认色谱系统能满足当前检测的要求。”
从上述的系统适用性试验的定义可看出，在实际工作中系统适用性试验是应当首先进行的，如其不符合要求，则不能继续进行实验，应当进行调整。理由显而易见，色谱系统不能满足当前分析的要求，产生的数据是不可信的。
三、如何设计HPLC分析方法的系统适用性试验？
3.1 什么时候进行系统适用性试验设计？
应该在分析方法开发阶段进行系统适用性试验的设计，主要是基于对方法性能的理解评估系统适用性试验的五个参数的风险，制定测试的方法考察其中的高风险因素。
3.2 理论板数风险评估
液相色谱法已经发展多年，理论与硬件均已较为完善，一般来说一个设计良好的HPLC分析方法的理论板数均比较高（＞10000），这种情况下一般理论板数下降导致方法性能不符合要求的风险相对较低，可以不必考察该参数。
某些特殊情况下如柱效下降较快、理论板数较低（＜5000），理论板数的下降可能导致方法性能如分离度、灵敏度、精密度等不符合要求的风险较高，需要考察该参数；但是制定理论板数的考察要求有一个难以克服的障碍是很难确定可接受的理论板数，因为在方法开发期间理论板数一般均符合要求，而理论板数的下降是一个随时间推移的渐进过程，在短时间内难以根据试验结果确定可接受的值；因此在系统适用性试验考察理论板数现在越来越少见。
与理论板数下降相关的系统适用性试验设计做法一般如下：
● 理论板数下降→峰形异常/分离度下降/灵敏度下降→系统适用性试验中考察拖尾因子/分离度/灵敏度等直接相关的参数。
● 理论板数下降→对方法性能影响不明显→规定系统适用性试验的理论板数不低于2000。
3.3 分离度风险评估
● 如果在方法开发期间发现主成分、主要受控杂质存在较近的相邻峰，需评估由于柱效下降、仪器差异、流动相性能差异等因素导致的分离度风险。一般基于充分的耐用性研究数据评估该风险：
● 耐用性研究各数据均分离良好，目标峰相隔很远，分离度风险低，无需考察分离度的系统适用性。
● 如在耐用性研究中发现分离度存在明显下降，甚至是不符合要求的情况，则认为方法的分离度风险较高，经过充分优化方法相关参数后（首选）仍然存在该风险的，应当制定相关系统适用性试验考察方法。
● 对于存在多个组分的情况，一般可以只评价分离度风险最高（分离度最差或下降最明显）的两个组分。
对于上述风险评估可分为两种情况进行讨论：
1)为研究用方法，不收载于质量标准中。这种方法使用的周期短，可以在确保方法验证符合要求的情况下制定较低的要求，如杂质间的分离度不小于1.2。
2)方法收载于质量标准，将在产品漫长的全生命周期中用于控制产品的质量。此类方法应当在方法开发阶段确认具有非常好的分离度（本文不提出具体数值，笔者建议应至少基线分离并有明显的间隔），使其能经受数十年中各种变化（如仪器品牌型号、色谱柱批间差异、试剂来源等）带来的挑战。分离度的系统适用性要求可以参考药典，规定为不小于1.5。
考察分离度的系统适用性试验溶液一般采用对照品制备；对于考察主成分与降解杂质分离度的情况，也可以采用主成分对照品降解制得。
3.4 度风险评估
杂质检测方法如有关物质、残留溶剂等在方法开发期间需要评估方法的灵敏度风险。在方法开发期间可以根据100%限度相当的对照品溶液信噪比或杂质定量限数据评估方法的灵敏度，方法如下：
● 研究方法的灵敏度相关数据的仪器灵敏度不宜过高，建议采用实验室灵敏度中等或较低的仪器。
● 如果限度浓度响应非常高，例如信噪比500以上，一般可认为方法的灵敏度风险低，无需考察。
● 如果限度浓度响应较低，如信噪比50，则认为方法的灵敏度存在较高的风险（不同仪器间灵敏度有差异），需要考察。
● 方法的灵敏度应当符合杂质控制策略的要求，如某杂质多批次检测结果均低于限度的10%经研究认为风险较低不进行常规控制，则系统适用性试验的灵敏度考察应确保相应方法的该杂质10%限度的信噪比不小于10。
● 一般采用主成分对照品溶液评估方法的灵敏度，应当对比不同杂质与主成分的灵敏度差异制定相关要求。如上文该杂质10%限度的信噪比为20，同等浓度的主成分信噪比为40，为确保杂质10%限度的信噪比不小于10，系统适用性试验中应规定同等浓度的主成分信噪比不小于20。如果灵敏度差异不能建立简单的换算关系，则应基于研究数据制定较为保守的要求。
3.5 拖尾因子风险评估
拖尾因子一般用于考察主成分峰，因拖尾因子的恶化可能导致与相邻峰的分离度变差，也可能导致响应值误差较大。它存在与理论板数同样的障碍，它也是一个随时间推移的渐进过程，在短时间内难以根据试验结果确定可接受的值。同样在系统适用性试验中较为少见。一般可以通过分离度、进样精密度等方法等直接参数评估拖尾因子的恶化导致的问题。
3.6 重复性风险评估
系统适用性试验的重复性主要用于评估高精密度方法（如含量测定）的进样误差；相对来说允许较大误差的杂质检测方法重复性风险较低，一般不进行考察。研究方法如下：
● 首先确认分析方法允许的误差，该误差为总误差，包括仪器进样、样品配制、样本属性等多个来源的误差。
● 计算总误差中分配给仪器进样的误差。
● 根据允许的仪器进样误差计算连续进样5次或6次的RSD可接受标准。
●如果实际仪器进样误差远小于计算值，例如计算得出的连续进样 5次RSD可接受标准为0.8%，实际值（综合耐用性、精密度数据）均不大于0.2%，仪器连续进样误差风险较小，无需考察。
● 如果实际仪器进样误差接近计算值，例如计算得出的连续进样5次RSD可接受标准为0.8%，实际值为0.5%~0.6%，仪器连续进样误差存在较大风险，应当考察。
注意系统适用性试验的重复性要求不建议不经评价地直接使用药典推荐的值（2%）。详细内容请关注本人的HPLC分析方法开发相关课程，如药视网公众号的“HPLC方法开发高手养成计划”或其他线下课程。
四、范例
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参数
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分析方法
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分析结果（范例）
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理论板数
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将耐用性研究项下的理论板数数据汇总，找出最小值，求出均值。
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理论板数的最小值为9212，远大于液相2000的理论板数要求，该参数风险非常小，可不考察
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分离度
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将耐用性研究项下数据汇总，一般为主峰与相邻已知杂质的分离度数据
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耐用性研究项下主峰与相邻已知杂质峰分离度均大于5，在降解试验中发现高温、酸破坏试验中均有与主峰分离度2左右的降解杂质峰，暂定取对照品高温破坏作为系统适用性试验方法。
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灵敏度
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列出各组分定量限验证数据
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各定量限浓度均低于限度的1/20，灵敏度风险较低，可不考察
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拖尾因子
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列出耐用性研究项下供试品溶液与对照溶液主峰拖尾因子的数据，评估对分离度与积分准确性的影响
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耐用性研究项下供试品溶液主峰拖尾因子均在1.4-1.6之间，分离度均大于2，对照溶液主峰拖尾因子均不大于1.2，连续5针主峰峰面积RSD%均小于0.5%，该参数风险较小，可不考察。
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重复性
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列出耐用性研究项下对照溶液进样精密度RSD数据
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见拖尾因子分析结果，因有关物质检测结果允许误差较大，该参数风险较小，可不考察。
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总结
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系统适用性试验溶液：取****对照品适量，加稀释剂制成每1ml约含**mg的溶液，置水浴中加热4小时，取出，放冷，作为系统适用性溶液。
判断标准：主峰与相邻降解杂质峰的分离度应不小于1.5。
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其他检测项目可根据实际情况参考上述方法制定相应的系统适用性试验。
