目前的方法未能充分地在皮肤组织工程模型中引入复杂的附件结构，如毛囊。近日，美国伦斯勒理工学院Pankaj Karande及其团队报道了使用3D生物打印将这些结构纳入工程皮肤组织。由打印皮肤乳头细胞（DPCs）和人脐静脉细胞（HUVECs）诱导的球状体，被精确地打印在含有成纤维细胞的预凝胶真皮层中。由此产生的组织在成熟时形成毛囊样结构，在角质形成细胞和黑素细胞的迁移支持下，它们的形态和组成与天然皮肤组织非常相似。重建模拟天然附件结构的复杂皮肤模型作为移植物和疗效模型来测试化合物的安全性可以对再生医学产生重大影响。
相关研究内容以“Incorporation of hair follicles in 3D bioprinted models of human skin”为题于2023年10月13日发表在《Science Advances》上。
图1 由不同细胞组成产生的复杂3D生物打印球状体的大小
图2 由不同细胞组成生成的复杂3D生物打印球状体的表征
本研究将HUVECs、人表皮角质形成细胞（HEKs）和人表皮黑素细胞（HEMs）以及DPCs一起纳入研究，形成球状体。评估由三种不同的细胞组合组成的球状体，如1型（仅DPCs）、2型（DPCs、HEKs、HEMs比例为10：20：2）和3型（DPCs、HEKs、HEMs、HEVECs比例为10：20：2：1）。仅DPCs的球状体从播种到第7天的直径减少（图1）。第4天在球状体2和3中加入HEKs和HEMs诱导聚集体的增大。
培养7天后，观察到球状体3和4可重复形成圆形和对称的球形聚集物（图2A、B），而球状体5导致细胞不对称聚集和分散结构（图2C）。组织学图像显示，球状体4与球状体3核心的形态学相似（图2A、B、D、E）。球状体5的组织学特征证实结构的对称性和顺序的缺乏（图2F）。在球状体3中，细胞角蛋白14（CK14）和CK10局限于鞘内（图2P、M），而在球状体5中，它们在整个结构中染色较差（图2R、O），尤其是CK10。在球状体4中，未检测到这些蛋白，这与该模型中HEKs的缺失相一致（图2Q、N）。CK5是毛囊外根鞘中HEKs的标记物，在球状体3型核心周围的表皮细胞鞘中呈强阳性（图2J），而在球状体4中完全不存在（图2K）。CK15通过来自上皮组织基底层的HEKs与CK5和CK14共表达，其表达与毛囊干细胞有关，在本研究模型中，检测到了CK15在球状体3核心（图2S）和球状体5核心（图2U）的表达。表明在球状体3中核心细胞最有可能是DPCs，保留一些干细胞特征。然后在球状体3和4中检测到IV型胶原，但在球状体5中没有检测到（图2G-I），表明适当的结构组织可能对该蛋白的表达产生影响。
图3 皮肤内毛囊的3D生物打印
图4 结合毛囊的3D生物打印皮肤模型的特征分析
为了用毛囊单位重建皮肤，将由DPCs和HUVECs组成的毛囊生物墨水打印在交联的真皮层内，并嵌入HDFs（图3A）。在真皮中打印毛囊生物墨水48小时后，观察到样品表面都含有细胞柱形成（图3B）。在本实验中，毛囊生物墨水由DPCs、HUVECs、HEKs和HEMs组成。HEM为结构提供色素沉着，便于柱的视觉观察。因此，虽然细胞不能像球状体3型那样排列成同心层，但在最初的实验中，采用这种方法来促进结构的宏观观察。
基底层HEKs向角质层的角质细胞渐进形态转变（图4A）。毛囊结构的形态与天然组织相似，外根鞘和内根鞘围绕着一个致密的核心（图4B）。IV型胶原的染色突出真皮-表皮交界处连续线的发展，部分轮廓毛囊结构（图4F）。CK10和CK14都均匀地存在于整个表皮中，CK10朝向结构核心，模仿内根鞘（图4C），而CK14主要朝向毛囊的外部区域（图4E）。CK15在表皮基底层和毛囊上层通过HEKs表达（图4D）。在整个表皮和毛囊的HEKs中都检测到CK5（图4G），且在DPCs和HUVECs的核心周围检测到更强的表达。在表皮上层检测到聚丝蛋白（图4H），与人类皮肤相似。在DPCs和HUVECs球状体周围的表皮鞘的内层也发现该蛋白，表明这些表皮细胞正在向结构的核心分化。在毛囊核心的中央底部区域检测到了ALP（图4I）。
综上，本研究能够使用3D生物打印技术自动重建一个复杂的人类毛囊模型。该方法产生一个具有同心细胞层的结构，模拟人类毛囊的3D组织。该模型可作为高通量筛选物质对毛囊细胞的潜在毒性或再生潜力的有用工具。在这项工作中还证明了仅使用人类原代细胞就可以生成一个包含毛囊结构的完全3D生物打印皮肤模型。值得注意的是，作为对以往毛囊再生方面努力的改进，3D生物打印方法不仅可以支持分离球体的制造，而且可以重建具有增强分辨率、速度和灵活性的皮肤模型。这项概念验证工作让我们能够更好地理解3D生物打印技术在皮肤内开发其他3D复杂结构方面的潜力和适用性，如血管系统、汗液和皮脂腺。此外，本文提出的方法可能会极大地影响毛囊模型的生成方式，并可能影响再生医学领域以及化妆品和制药行业的安全性和有效性评估。
文章来源：DOI: 10.1126/sciadv.adg029
