单个细胞或小细胞团进行增殖以及重组最终构成复杂且有组织的细胞结构，这些细胞结构可以模拟特定器官的功能，被称之为类器官。类器官的细胞来源可被大致分为两类，原代组织和多功能干细胞分化。尽管每个组织的类器官的形成过程会存在差异，但是类器官的大体形成过程遵循以下流程，增殖、分化、细胞分选、谱系定型和形态发生，形成3D类器官结构[1,2]。
在类器官的培养过程中，细胞往往需要在培养基中进行不受抑制的增殖，而这种不受抑制的增殖可以在低黏附的培养环境或生物材料中实现。生物材料可以模拟组织中天然的细胞外基质为细胞提供3D的培养环境；此外，生物材料还可以是多种不同的细胞外基质和多种生物因子的混合，这种复合的环境有利于细胞的粘附和增殖，并且生物材料可以在类器官的形成过程中酶解和重塑[3,4]。
目前，常见的用于构建类器官的生物材料有，脱细胞组织，天然高分子材料，合成肽材料（表1）。不同的生物材料有着不同的特性，比如脱细胞组织有着与宿主组织高度相似的细胞外基质成分，合成高分子材料有着可控的良好的机械性能等；而这些不同的材料特性又会对细胞行为进行调控，例如，脱细胞基质材料有利于细胞的体外黏附，有序排列的高分子材料可以促进人类肌腱干细胞的分化等[5,6]。
表1 用于构建类器官的生物材料及其来源
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类别 |
材料来源 |
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脱细胞组织生物材料 |
猪肝组织，人肝组织，猪胃组织，猪小肠组织，猪肾脏组织，小鼠肉瘤（Engelbreth–Holm–Swarm基质） |
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天然高分子生物材料 |
家蚕茧，透明质酸，胶原蛋白，海藻酸盐，胶原玻璃质凝胶，管状丝海绵，纤维蛋白-层粘连蛋白 |
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合成高分子生物材料 |
聚乙二醇及其衍生物，Amikagel，聚乙交酯类，聚左旋乳酸类 |
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合成肽生物材料 |
PeptiGel Alpha4，PeptiGel Alpha5 |
基于以上内容，本文从构建类器官的生物材料角度切入，整理不同生物材料在类器官构建方向的应用供大家参考学习！本期内容主要分为两部分，一是重温类器官相关的经典综述，二是结合本期主题为大家带来相应的代表性文献。
一、代表性文献综述回顾
文献1 Nature Reviews Methods Primers (IF 39.5 )：类器官
主要内容：类器官是基于细胞的组织工程体外模型，再现了相应体内组织的复杂结构和功能的许多方面。目前已经报道了许多支持类器官培养和生长、增殖、分化和成熟的类器官工程策略。为此，本文强调了选择和发展这些材料的基本原理和控制细胞/组织生态位的方法。该综述还介绍了成功构建类器官的关键因素，例如种子细胞的分离和接种、基质和可溶性因子选择、物理因素和整合相关的因素；作者还介绍了关于类器官的数据质量、重现性的一般标准。最后，作者详细阐述了类器官在不同应用中的局限性，以及未来几年类器官的关键优先事项。
图1 类器官的组成部分
原文链接：https://doi.org/10.1038/s43586-022-00174-y
文献2 Nature Reviews Materials ( IF 83.5 )：工程类器官
主要内容：在传统类器官培养过程中的存在着许多局限性，而这些局限性可以将类器官的各个组分进行工程化来解决。因此，本文详细介绍了通过细胞表面和基因工程方法构建工程类器官，并讨论了基于时间和空间控制的矩阵设计对于干细胞生态位的影响。同时，本文总结了通过微流控技术和器官芯片技术构建类器官的经验，展望了如何通过整合这些机械生理参数增加类器官构建的可重复性。
图2 组织来源的类器官
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41578-021-00279-y
文献3 Annual Review of Neuroscience ( IF 13.9 )：脑部类器官研究中的挑战
主要内容：类器官可模拟正常或病理发育特征的脑组织，可作为探索人类大脑发育的工具。本文介绍了多功能干细胞（PSC）衍生的神经培养物，以及相关的复杂的神经类器官，这些类器官为揭示人类大脑发育的特征和探索大脑发育与人类疾病的相关性提供了一个极好的平台。此外，本文认为类器官模型在功能和疾病表型研究中有一定的局限性，例如在高度特定的细胞类型、功能回路的形成和活动、以及中枢神经系统驻留神经元和非神经元细胞类型之间相互作用的研究中。
图3 大脑类器官的特点
原文链接：https://doi.org/10.1146/annurev-neuro-111020-090812
文献4 Hepatology ( IF 13.5 )：类器官和再生肝病学
主要内容：本文探讨了3D类器官培养的发展进程，类器官将如何应用于肝胆系统，以及类器官技术如何与全球新兴的肝脏再生医学领域相交叉。本文还总结了可用于类器官培养的肝细胞、胆管细胞和非实质类器官系统，并讨论了它们对于再生医学的优点和局限性以及未来的方向。
图4 肝病再生医学
原文链接：https://doi.org/10.1002/hep.32583
文献5 Nature Materials ( IF 41.2 )：下一代肿瘤类器官
主要内容：本文重点介绍了下一代癌症类器官标准化培养得新方法，并展望了如何可重复且准确地构建肿瘤异质性类器官。此外，本文认为对于构建肿瘤类器官的改善需要临床医生、生物学家和工程师的跨学科努力。成熟的肿瘤类器官将会重塑个性化治疗的方式，并加速临床治疗的转化，从而极大地改善患者的治疗效果。
图5 下一代肿瘤类器官
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41563-021-01057-5
二、代表性研究文章回顾
文献6 Biomaterials (IF 14.0)：脱细胞肝组织来源的水凝胶用于胆管细胞类器官的生长和分化
材料：猪肝组织，人肝组织，Matrigel
方法：分别将离体猪/人肝组织进行脱细胞处理，随后进行冷冻干燥处理。用胃蛋白酶对组织进行酶解，随后将体系pH调节至中性/弱酸性得到预交联溶液。将预交联溶液置于37 ℃培养箱孵育30-45分钟可得到猪（PLECM）/人（HLECM）脱细胞肝组织来源的水凝胶。对肝组织中的细胞进行分离，后将这些细胞先于基底膜基质（BME）培养两代后转移至PLECM/HLECM继续培养，随后对其进行类器官评估的相关考察。
结果：PLECM/HLECM水凝胶可支持胆管细胞类器官的增殖并维持胆管细胞样表型；PLECM/HLECM水凝胶不会改变目的蛋白或基因的表达，例如胆管细胞标记物（细胞角蛋白-7），并且在PLECM和HLECM水凝胶之间并未发现由种属差异来带的不同结果。
图6 PLECM/HLECM水凝胶的制备过程及相关考察
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2022.121473
文献7 Nature Communications (IF 16.6)：来源于组织细胞外基质的水凝胶作为基质胶的替代品用于胃肠道类器官的培养
材料：猪胃/小肠组织，Matrigel
方法：通过曲拉通X-100对胃/小肠组织进行脱细胞处理，得到脱细胞胃源性细胞外基质（SEM）和脱细胞小肠源性细胞外基质（IEM）。通过胃蛋白酶酸性溶液的处理得到预交联的SEM/ IEM溶液，将该溶液与磷酸盐缓冲溶液混合后调节pH至中性，通过温度诱导的自组装行为得到SEM/IEM水凝胶。从6-8周雄性C57BL/6小鼠的胃/小肠中分离腺体/隐窝，并在SEM/IEM水凝胶中进行培养，随后对其进行类器官评估的相关考察。
结果：在胃肠道类器官的增殖和功能化中，SEM/IEM水凝胶展现类似于Matrigel的性能，并在大部分情况下下展现出优于Matrigel的性能。此外，SEM/IEM水凝胶通过提供胃肠道组织模拟微环境，实现了类器官的长期传代培养和移植。通过蛋白组学分析阐明了组织特异性和年龄相关的细胞外基质对于类器官发育的影响。
图7 SEM/ IEM水凝胶的制备过程及相关考察
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-022-29279-4
文献8 Advanced Science (IF 17.521)：肾脏脱细胞细胞外基质材料用于增强人肾脏类器官的血管化和成熟
材料：猪肾脏，Matrigel
方法：将新鲜的猪肾脏组织去除肾包膜，肾周脂肪，肾内脂肪和肾髓质，将剩余的皮质组织进行冷冻切片处理，随后将切片进行脱细胞处理。将脱细胞后的组织进行冷冻干燥处理，随后对于进行酸处理酶解，得到预交联肾脏脱细胞细胞外基质溶液（dECM）。用预交联溶液对24孔板进行包被，并将人诱导性多能干细胞（hPSC）进行铺板，随后将Matrigel进行铺板，制备“三明治”类器官培养体系，随后对其进行类器官评估的相关考察。
结果：单细胞转录组学显示，与未使用肾脏dECM培养的血管化肾脏类器官相比，使用肾脏dECM培养的血管化肾脏类器官具有更成熟的肾小球发育，并且与人类肾脏具有更高的相似性。通过使用肾脏dECM的培养方法，使用CRISPR/Cas9敲除由hPSC分化得到的肾类器官中的β-半乳糖苷酶A (GLA)，可有效重现法布里肾病伴血管病变。将肾dECM培养的肾类器官移植到小鼠肾脏中，可加速从宿主肾脏招募内皮细胞；相比于没有肾 dECM培养的肾类器官，该体系可通过组织的裂隙隔膜样结构来维持血管完整性。该肾脏dECM培养体系可用于诱导肾脏类器官广泛血管化，研究肾脏发育、疾病建模和再生医学应用。
图8 肾脏dECM的制备过程及相关考察
原文链接：https://doi.org/10.1002/advs.202103526
文献9 Advanced Healthcare Materials (IF 10.0)：使用低浓度胶原蛋白生物墨水对乳腺肿瘤细胞和类器官进行嵌入式生物打印
材料：家蚕茧，胺封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺，pNIPAM），透明质酸（HA），4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)−4-甲基氯化吗啉（DMTMM），I型牛胶原蛋白
方法：通过煮沸透析消化等处理得家蚕茧溶液（SF）。将pNIPAM通过偶联剂DMTMM修饰在HA的骨架上得到HA–pNIPAM。将I型牛胶原蛋白通过1N氢氧化钠溶液中和后得到胶原蛋白前体溶液（collagen），将HA–pNIPAM与collagen共孵育得到collagen–HA–pNIPAM (CH) 前体溶液，随后在37℃下对CH前体溶液进行聚合得到CH水凝胶。从12周C3小鼠的肿瘤组织中分离相关细胞，并将细胞与CH前体溶液混合，在SF通过生物打印得到相关肿瘤类器官，并对其进行相关评价。
结果：在SF水凝胶浴的支持下，可以对低粘度I型胶原进行高形状保真度的生物打印；并且在I型胶原蛋白生物墨水中添加HA-pNIPAM可保持不同亚型乳腺癌细胞和肿瘤相关成纤维细胞的原始表型。这种生物打印体系进一步验证了高通量制造肿瘤类器官模型的优势，该体系成功复制了体内肿瘤形态和细胞表型。此外，通过简单地调整基于胶原蛋白的生物墨水成分和打印图案，可以制造具有复杂结构和至少三种类型细胞的器官模型。
图9 CH类器官的构建和相关评价
原文链接：https://doi.org/10.1002/adhm.202300905
文献10 Bioactive Materials (IF 16.8)：全合成肽水凝胶用于人诱导多能干细胞 (hiPSC)的生长和分化构建衍生肾类器官
材料：自组装肽（PeptiGel Alpha4，PeptiGel Alpha5）
方法：通过PeptiGel Alpha4构建低刚性水凝胶（Alpha4），PeptiGel Alpha5构建高刚性水凝胶（Alpha5），用于培养肾类器官。并对Alpha4和Alpha5肾类器官的流变、溶胀、形貌、分化情况、活力、增殖等进行考察。
结果：自组装肽水凝胶(SAPH)作为3D仿生环境，可用于hiPSC衍生的肾脏类器官的构建。由SAPH内培养的功能性肾细胞类型，可知SAPH足以用于肾类器官培养，从而不需要复杂的、定义不明确的动物源性基质（例如基质胶）。通过scRNAseq，SAPH还揭示了体外生长环境对产生组成不同的细胞类型和扰乱细胞命运的影响。与较软的Alpha4相比，较硬的Alpha5生成的类器官中含有更多成熟足细胞并且肾单位细胞类型比例增加。与在气液界面生长的肾脏类器官相比，在3D基质内生成的类器官具有更少的脱靶细胞类型，这说明了生物物理环境对细胞行为的调控。
图10 SAPH内形成的 hiPSC衍生肾类器官的分化方案和后续表征
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2022.08.003
参考文献
[1] Zhang W, Li J, Zhou J, et al. Translational organoid technology–the convergence of chemical, mechanical, and computational biology[J]. Trends in Biotechnology, 2022.
[2] Luo L, Liu L, Ding Y, et al. Advances in Biomimetic Hydrogels for Organoid Culture[J]. Chemical Communications, 2023.
[3] LeSavage B L, Suhar R A, Broguiere N, et al. Next-generation cancer organoids[J]. Nature materials, 2022, 21(2): 143-159.
[4] Jiang L, Shen Y, Liu Y, et al. Making human pancreatic islet organoids: Progresses on the cell origins, biomaterials and three-dimensional technologies[J]. Theranostics, 2022, 12(4): 1537.
[5] Li C, Zhang Y, Du Y, et al. A Review of Advanced Biomaterials and Cells for the Production of Bone Organoid[J]. Small Science, 2023: 2300027.
[6] Tomofuji K, Fukumitsu K, Kondo J, et al. Liver ductal organoids reconstruct intrahepatic biliary trees in decellularized liver grafts[J]. Biomaterials, 2022, 287: 121614.
