本文以气相色谱开发为索引进行简单的小结和扩展，本着个人经验与判断进行叙述。文章简单进行如下区块划分：其一，近些年实验过程中所遇到的小BUG分享；其二，气相色谱/质谱分析方法常规流程分享。
有着自己“小脾气”的分析仪器
每台机器都有着属于自己的“脾气”，长期从事分析行业的老师们可能或多或少的都有感觉“分析仪器会认主！！！”，有时候用自己的仪器用的万分顺手，奈何在进行中间精密度实验的时候总有需要更换同型号仪器实验的情况，一旦更换仪器就得万分小心。。。（忽如一夜秋分来，偏差领到手抽筋。。。）因为压根不知道会出现哪些小bug~~~（下文所列出的BUG希望各位分析人永远都不要遇到~阿弥陀福~BUG退散~~~）
虽然目前气相/液相等分析都在做，但究其出身来看本人还是属于气相背景的，自大学伊始就在环境评测实验室进行学术研究，正因如此初到公司所管理的仪器便是气相+气质，当时年少无知…一看到自己所管理的仪器那叫一个意气风发啊~不就简单的GC吗…学习期间都已经摸得滚瓜烂熟了，丝毫没有挑战性！（生活的大棒砸下来的太快！）由于工作安排等原因，入职两周便开始独立进行分析并兼任仪器的维护、核查，可能是仪器欺生？自己刚开始独立上岗各种仪器BUG就找上门来了…
一、仪器报错“External device not ready”
“External device not ready”这个报错…我能说到现在都还没能完全解决吗？期间也约了安捷伦工程师远程+现场排查（硬件、应用、软件工程师轮番上阵）愣是没能把这个报错给消除掉…虽然有办法正常进样…但就是每次看着亮着黄灯（报NOT READY）的仪器心里发堵 （心里难受却又不知道如何表述）
▲图1-8890 GC端报错显示
▲图2-7697A 顶空进样器端仪器显示
这个报错在仪器硬件固件版本升级后就一直出现（软件控制采用Mass Hunter），当初工程师上门升级固件后仪器正常运转也没在意，到第二天序列跑完后就发现仪器无法READY，随即联系硬件工程师上门排查未能发现原因，后续经过多轮测试暂且摸寻出“External device not ready”的报错会在气相色谱&顶空进样器端均进行重启后消失，仪器均可READY（质谱7010端可以不进行重启）。
但在进行进样操作后（不论是单针进样运行方法还是序列进样），仪器随即无法进入READY状态，一直报错“NOT READY：External device not ready”，这个报错状态已经影响到仪器的正常使用，不可能每次进样前都对顶空进样器和GC端进行重启！
也考虑到其报错是外部设备未就绪，我司联合安捷伦软、硬件工程师多次对顶空设备和直接进样器进行排查（期间甚至换过一个直接进样塔并对顶空的固件进行了升级），发现直接进样的仪器方法需对GC端进行重启，顶空进样的方法需对顶空+GC端进行重启后，此报错才能消失。
后续跟安捷伦工程师协商后再度对软件版本进行升级此报错亦是无法消除，但仪器可以正常使用了！经测试，仅报错“External device not ready”状态下仪器能够正常进样，无干扰！
（上述情形如各位同仁有所涉猎亦是欢迎交流！）
二、7010质谱调谐BUG
7010质谱调谐过程报错“2.5放射电流控制器无法在指定的时间之后调节请求的设置”，这个报错之前一直存在！维护这台仪器的前辈均是当作离子源灯丝烧断来处理的，而且就往常经验来看…也确实切换灯丝就能够实现正常调谐！灯丝烧断，切换灯丝！皆大欢喜！
▲图3-7010质谱调谐过程报错
奈何就是出现了我这种不走寻常路的人…在某次GMP项目之前，处于对实验项目负责的态度（Ps.以防意外发生产生偏差…小命要紧），本人对仪器进行了“术前”…不对…进样前的最终确认和维护！
仪器出现上述报错…我并未进行灯丝切换，而是对离子源进行拆卸维护！！！（不走寻常路 nice~）
▲图4-f7010质谱离子源
这不拆不知道~一拆吓一跳…图4中离子源状态距离上次清洗仅一周时间…可见期间分析的中药样品是多么的emmm…，清洗完干干净净的离子源重新装机，阴差阳错之下…不知道为何就是想更换一个新的灯丝试一试仪器情况（说白了就是GMP项目想用新灯丝了…自己找了个说服自己的借口 ）。
▲图5-7010 新灯丝装机纪念
新灯丝上机后经过一番祈祷后（可能是有用了！）开始进行调谐，好么~~~报错依旧未消失。
▲图6-报错依旧
“2.5放射电流控制器无法在指定的时间之后调节请求的设置”仪器故障…仪器故障已清除…1号灯丝依旧无法使用，只能切换2号灯丝使用，这可是新换的灯丝啊！！！好几千大洋呢！！！得…还是GMP放行要紧先让仪器稳定好等后续有空在进行研究。
这一耽搁…又是过去了数周，等我回想起来的时候切换灯丝1又能够正常使用了！！！后续检测过程中也时有发生，联系安捷伦售后也无法解决这个问题，我们本着稳定使用的原则，每当出现这个问题就进行切换灯丝的操作，这个BUG也成为了一个未解之谜 。
三、仪器被未知用户占用
7697A-8890-7010在进行顶空进样的时候出现被踢下线的情况，要知道这台设备是通过Mass Hunter单机软件进行控制的，无第二组信号源接入，且顶空进样器已经完成1号样品瓶进样，GC-MS端正在进行样品数据的采集，具体报错如下图7中所示。
▲图7-系统提示HS被另外电脑占用
图7中可以看到警告提示HS在监控模式被另外电脑占用，可是本台仪器有且仅有这一个MassHunter 控制端，并且此提示过程中可以看到左上角的仪器状态部分，GC和MS均处于脱机状态！正常进样第一针…第二针进入顶空瓶预热过程中随机出现仪器脱机情况…
随即重启软件并检查仪器端显示情况，如下图8.
▲图8-系统提示HS被另外电脑占用
上图是8890端液晶显示器的部分，可以看出Col1和Col2两个色谱流路均被占用，Col2流路所加载的应该是软件重启后所带的FID方法，此FID方法是用于上次检测的用途，而本次所使用的顶空方法为Col1中的MS方法。也就是说仪器被异常占用后仪器默认当前方法失效从而调取的上次进样方法来进行加载，从而仪器硬件所得到的download模式就变成了双色谱柱进样模式？！（之前有听血液酒精测试的同事说过这种类似的双色谱进样？有熟悉的老师可以帮忙科普一下！）
解决方案：对所属仪器进行完全性断电重启即可。
在故障排查过程中也尝试过重启软件和重启硬件，软件重启后脱机状态消失但是依然无法正常加载方法，可对仪器进行放空操作！仪器放空后无法正常抽真空！！！多次进行抽真空操作均会造成软件脱机，随后尝试进行GC端和HS端的重启操作无法解决问题，MS端也进行短时间断电重启操作，问题依旧无法解决，最终对仪器进行完全的断电，静止半天后于当天下班前重启成功！仪器恢复正常连接。
此故障自本人接触分析仪器数十年以来第一次遇见！已经向安捷伦售后报备，暂无进一步反馈！
四、其余故障
▲图9-PE的HS-40进样器维护报警
PE的40位顶空在日常研究过程中亦是常有用到其经常性的会出现维护报警（严重的时候一个序列报警一次，对进样次数进行重置后亦未能消除），经过排查并非仪器进样次数限度设置问题（仪器中有一个进样次数的计数器，正常来说进样一定次数后便会警告提示需要对顶空进样器进行系统维护），后联系PE官方从南京派遣来了一位应用工程师进行进样器的系统维护后问题未再次发生。
▲图10-CTC进样器白屏
上述是一台外挂在7890B气相色谱上的瑞士CTC进样器，此进样器由于能够兼容直接进样和顶空进样两种形式从而被广大研究人员所青睐，本次故障是在正常进样过程中进样器液晶遥控器出现白屏现象，遥控器上4个按键均“失灵”索性由于仪器方法已经download完成，并未对此次进样序列产生干扰。通过断电重启完成故障排除。
五、仪器BUG小结
在我们日常分析检测过程中或多或少会遇到一些仪器使用问题，只要对仪器精心维护，总体来说具有经验的“老法师”们往往也都能够很好的排除掉。（Ps.重启大法虽然好~但是不要随便乱用喔！尤其是冬天重启过程中可能会出现静电电涌，对仪器的电路板造成击穿！！！）个人小结几点仪器容易出现BUG的节点，供各位“法师”们参考！
1、自己管理的仪器借给他人使用的时候，尤其是借给他人进行方法开发时，不是别人使用出现BUG就是仪器换回来的时候使用不顺手！
（一般公司不会奢侈到人手一台仪器吧？普通气相液相还好说，三重四级杆质谱和高分辨质谱啥的不可能人手一台的吧？！所以同事间相互占用是很正常的事情！）
解决方案：注重仪器管理人员的培养并强调仪器管理人员和品牌方工程师之间需要紧密沟通，倘若仪器有购买年度维保计划，那就多多的加强和维保工程师的联系，从每次维保过程中充分发挥培训作用，有效的将分析应用人员向综合仪器工程师转化，至少保证公司内有一位熟悉仪器硬件的人员，从而更好的排查仪器BUG，保障仪器的正常运转。
2、未连接UPS电源的仪器长期关机时请将插座拔下，尤其是部分高校实验室的应用场景，市政供电电路未能充分考虑供电稳定性，而UPS电源能够有效充当稳压稳流的作用，以免突然断电或者长期断电后仪器重启时产生不稳定电流对仪器造成损坏。
3、在进行部分痕量物质分析过程中，需要充分对仪器进样器、隔垫、传输管线、进样针的限位器等等进行全面清洗和维护，以免在开发过程中所完善的方法，再进行验证时出现未知原因的干扰，如在开发过程中能够稳定出峰的目标物实际为外界干扰所物。之前出现过进行环境外源性污染物的残留测定过程中一直有基质干扰，最终排查下来发现是由于进样针限位器末端残留所引入干扰的情况。气相色谱的开发有时候就跟程序员开发的程序类似，开发过程一切OK，一旦验证过程中发现来BUG并且又想去修复他…这时候…雪崩就开始了，一旦修复其中某一BUG就会产生连带效应，从而造成全盘推翻前期开发的所有工作的情形！
并且气相色谱的开发过程中经常性的会发生各种人机不合的小bug，仪器正常运行的话大家一直相安无事好几年~但是…有可能就是仪器换人使用的这一次…一旦出现问题就会产生无从排查的尴尬境地。只能一点点的从进样口开始排查，也往往进样口发现问题最多！安捷伦工程师统计故障来看，气相色谱所出现的所有应用BUG中，90%都是由于进样口的问题所造成的！
气相色谱/质谱分析方法流程知多少？
话不多说，先上干货！
▲图11-GC/GCMS方法开发流程图
（上述流程仅为自身经验小结，仅供各位小伙伴参考使用，并不保证普适性）
随着现代精细化工的不断发展，气相色谱法在日常分析中越来越被受重视。对于一个新产品来说其质控检验是非常重要的。下面将简单小结一下日常GC/GCMS分析方法开发过程。
通常分析方法的开发分三步走~
1、供试品、目标物及应用目的等信息确认；
2、检测器及色谱柱筛查及选择；
3、方法预验证及正式验证。
供试品、目标物及应用目的等信息确认：
首先我们分析人员接手项目时要与技术支持部门的同事（部分扁平化管理的公司可能会出现技术人员直接跟销售人员对接客户需求的情况）确认好本次GC分析方法开发用途及目的！！！
我们需要精益求精！但现实告诉我们社会中…人无完人！！
就像2015版药典发布之前各个药厂的申报资料中对于新型目标物含量测定均遵循CDE含量测定公告的统一原则，不论目标物在供试品中的占比多寡~均要求其精密度RSD达到2%以内，准确度达到98%~102%一样…甚至可以要求更高！
越高的要求~对仪器的维护要求更高，对于仪器的专一性将会提出更为严格的要求！因此对于用户目的一定要明确！！！将以交付目的的方法开发验证和以研究为目的的方法开发区分开来，从而才能更好的做到高效、专注！
再者，确认样品的状态：中控反应液；样品纯度；溶残种类以及样品稳定性！
最后，确认目标物的理化性质，溶解性和稳定性等；一般适合使用气相分析方法检测的目标物：其是可挥发、热稳定性好、分子量通常小于500、沸点一般不超过300℃、在液相中几乎无响应、大部分含有四元环、五元环和六元环结构、部分桥环螺环结构等。（注意：当化合物为盐酸盐时需要进行游离后进样。）
检测器及色谱柱筛查及选择
检测器选择：
▲图12-检测器性能示意图（图片摘至安捷伦大学培训教材，侵删！）
通常开发过程中是需要根据目标物进而匹配适宜的检测器，当然MS可测万物~~~，部分客户为了匹配自身仪器情况且节约后续转移成本会要求开发尽可能避免MS方法，转而要求开发适宜的GC方法！
检测器选择不仅要看检测器限度（图12），而且要看检测器性能匹配度！如图12中所示，ECD检测器的限度能够达到fg级别甚至一度低于MS检测器，但是其由于工作原理等特性（下期文章简单介绍一下GC的各种检测器工作原理！）以至于ECD的普适性不广！其中NPD检测器亦是如此，其由于铷珠的特殊情况，仅支持N、P的检测。
色谱柱的选择：
通常实验室中供给气相色谱所用的载气以氮气为主，少见有氦气作为载气的，原因也很简单，目前氦气的供气价格（50L钢瓶气）是氮气的30倍以上！！！
一般而言只有三重四级杆的气相系统采用氦气做载气（安捷伦碰撞气为氮气、岛津为氩气），因此在方法开发过程中不同于液相进行流动相更换，气相色谱开发很少会改动载气类型，所以GC方法开发核心在色谱柱筛选上，色谱柱筛选思路如下：
固定相的选择：如果不确定要使用的哪种固定相，可从DB-1 或DB-5 开始。
内径：高柱效的色谱柱，请使用0.18-0.25 mm 内径的色谱柱；如果需要较大的样品容量，请使用0.32 mm 内径的色谱柱；大口径直接进样器时，才使用0.53 mm 内径的色谱柱。特别适用于高载气流速的情况，例如吹扫捕集、顶空进样器0.53 mm 内径色谱柱在恒定的液膜情况下具有最高的样品容量。
柱长的选择：如果不知道最佳长度，请使用25-30 米长的色谱柱。主要看分离度。
膜厚的选择：厚液膜色谱柱用于保留和分离挥发性溶质。厚液膜色谱柱惰性更强，容量更大。厚液膜色谱柱具有较高柱流失性，使用温度上限也有所降低。薄液膜色谱柱用于将高沸点高分子量溶质，薄液膜色谱柱惰性较弱，容量较小。薄液膜色谱柱的气密性较好。
初始分离条件：低于溶剂沸点20°C的起始温度，10°C/min升至色谱柱耐受温度以下20°C，保持10min。
色谱柱筛选过程中关键判定因素：
1.峰形
判断标准：峰型良好，没有严重的峰前伸和峰拖尾现象；
（药典标准拖尾因子在0.95~1.05之间，通常方法开发过程中如未预见干扰峰对峰形的判定可适当放松）。
出现严重的峰拖尾现象怎么办？
首先，检查仪器的进样系统有没有污染的可能性；（如：隔垫、衬管等，是在没辙也可以检查一下分流平板，金垫一般建议2年左右更换一次，也遇到过实验室仪器寿命内未更换依旧正常进样的情况）
其次，确认色谱柱装载是否正确！新手请带教老师确认色谱柱切割的是否平整！不同品牌的仪器螺母扭矩需确认以避免色谱柱端的泄漏情况；（先用手拧紧柱帽，再用扳手拧紧。安捷伦：大拇指轻微用力，带不动为宜，此刻扭矩合适；岛津：扳手拧紧后回1/4圈为宜。）
若峰拖尾现象仍无明显改善，选择更换色谱柱柱效较好的色谱柱；若更换后峰拖尾现象无明显改善，尝试其他不同类型色谱柱；（色谱柱极性需区分清楚，针对不同的物质使用不同极性的色谱柱，理论来说适宜的前提下色谱柱极性越大目标物分离效果越好！）
1、柱长越长，分离效果越好
2、内径越小，保留能力越强
3、膜厚越厚，保留能力越强
（如后续有需要可更新GC/LC色谱柱选择的文章！）
出现严重的峰前伸现象怎么办？
首先确认是否为色谱柱过载，调整进样量或者以新开封的标准品重新配制新的溶液进行测试；
也可以尝试适当增加分流比。
不同溶剂的变化亦是对峰形有着致命的影响（图13），因此在进行色谱柱选择的过程中需要充分了解目标物和供试品的理化特性！！！
▲图13-100ng/ml的硫酸二甲酯在不同溶剂中的响应（色谱柱：HP-5MSUI）
2.分离度
当分离度（R）＞1.5时，满足检测要求。
当分离度（R）＜1.5时，尝试在原有体系里调整梯度进行分离。
若尝试调整梯度，R ＜1.5，考虑换其他类型色谱柱和检测方法。
3.保留时间
RT：一般是指数据采集伊始为0min，目标组分色谱峰定点所标示的时间位点为该组分的保留时间。
气体流速异常（检查EPC控制器）、升温程序异常（校准OVEN）、色谱柱污染（适当切割色谱柱柱头）、分流/放空管路异常（检查管路是否泄漏堵塞或者电磁阀故障）、色谱柱异常（检查柱效、规格和老化情况等）
方法预验证及正式验证
根据《中国药典》2020年版9101：分析方法指导原则（图14）可知，一套完整的定量分析方法验证需要完成系统适应性、专属性、线性及范围、检出限、定量限、精密度（重复性和中间精密度）、准确度、耐用性、溶液稳定性等参数的测试。
在常规方法学开发过程中为了保证方法的重现性以及普适性，往往会通过预验证对方法进行最终检查，完整的预验证通过后方可进行正式验证，正式验证中的中间精密度测试（人员、仪器、时间三个参数选择两组参数进行更换后再测试）则是对现开发的方法最终复核！！！通过多道措施保障方法的准确性！
▲图14-9101：分析方法指导原则检验项目&验证指标（摘自中国药典2020版四部）
进样口温度：对准确度（回收率）的影响因素
▲图15-A:甲磺酸甲酯，沸点210; B:甲磺酸乙酯，沸点220; C:甲磺酸异丙酯，沸点230
实际开发过程中常常接触到磺酸酯类物质，其沸点均高于200℃，常规方法我们是否对进样口温度设定均会高于250℃？但实际研究表明，进样口温度设定在300℃时，上述三种磺酸酯类物质在沙坦类供试品中的回收率高达130%~200%，在众多排查无果后我们尝试对进样口温度进行降低处理，当进样口温度降低到150℃时，目标物回收率达到96%~115%，其准确度达到可接受标准。（磺酸酯类的衍生终止剂推荐使用Vc可以很好的降低光干扰，从而有效提高准确度！）
添加剂：对准确度（回收率）的影响因素1
▲图16-杂质研究1
对丙二腈杂质研究过程中发现，直接溶解后进样无论如何都没法提高其回收率（一直在30%~40%左右波动），一度准备放弃后进行限度验证！！！随后抱着死马当活马医的心态在其溶液体系中加入强酸0.5%甲酸（简称FA，下同）回收率瞬间飙升达到95%~102%，气相分析偶尔会添加FA和氨水…但是其比例基本都在0.1%左右，0.5%的强酸环境对色谱柱也是极大的考验！发现回收率OK后又进一步对色谱柱进行筛选，最终完成项目交付！
色谱柱小知识：
HP-5和DB-5均为5%的苯基，但键合在直链和支链上的比例不同
HP-5：弱酸性，适合中性和酸性化合物
DB-5：弱碱性，适合碱性化合物的分析
添加剂：对准确度（回收率）的影响因素2
▲图17-杂质研究2
同样的回收率问题亦是发生在N, N-二乙基苯胺的研究过程中，研究期间一度尝试添加氨水以保证目标物的稳定性！奈何回收率最多只能做到65%，整个团队都对项目抱有悲观的态度！（毕竟当时手上项目多，也有很多退单的情况！）一咬牙一跺脚…上了1%浓度的氨水~~~回收率蹭的一下…又上去了！达到106%~115%，有惊无险的压着项目周期交付！
添加剂：对溶解度的影响
▲图18-杂质研究3
老法师们估计发现了！图18中的排版发生了变化，样品放到前面来了~硫酸二甲酯已经是被充分研究过的目标物了~这次难溶的是供试品吉美嘧啶！在有机溶剂中的溶解性不是很好，因为是嘧啶的缘故尝试采用浓氨水直接溶解，没有问题，但是不太适合进样…常规浓度0.1%~1.0%浓度氨水添加，溶解效果不是很好，且水溶液直接进样对色谱柱有一定的风险。因此提高氨水浓度，更换稀释剂种类，当50%甲醇:水作为稀释剂，氨水浓度提高到7.0%时能够充分溶解限度设计水平的目标物，回收率落定在95%~110%区间内！
最后，由衷的希望各位分析人项目交付能够快速！高效！稳定！
