传统化疗药物治疗癌症通常是通过阻断细胞增殖的关键过程实现的。但化疗药物不能选择性在肿瘤部位富集是其使用受限的重要原因。因此，通过偶联靶向肿瘤抗原的抗体为这一问题的解决提供了方案，即大家所熟知的ADC产品（Antibody-drug conjugates）。ADC是抗体与一种细胞毒分子通过合适的连接子连接起来组成的分子。
ADC的主流认识是抗体部分直接结合肿瘤细胞表面的抗原，之后被内吞，细胞毒类药物在细胞内释放，继而发挥抗肿瘤作用。但其实抗体内吞效率在不同靶点间的差别很大，很少能达到100%内吞程度，也就是有一部分ADC并不是在胞内发挥的作用，而是在细胞外的毒素释放发挥的作用。而内吞和非内吞之间，胞内和胞外毒素之间，在抗肿瘤作用中的贡献，很难通过体内实验研究清楚。这也就提出了一个疑问，ADC一定要内吞才能发挥作用吗？ADC的药效主要是内吞后的毒素发挥的作用吗？非内吞型的ADC有开发价值吗？
非内吞ADC产品作用机制
ADC通常被设计为通过内吞发挥作用，抗体首先结合到肿瘤细胞表面的抗原，之后被内吞至细胞内，并在溶酶体内完成蛋白降解，释放出偶联的毒素，杀死所在细胞。而且，毒素在胞内释放杀死靶细胞后，尚未失活的毒素可以被动扩散到旁边的肿瘤细胞，持续发挥杀伤作用，即旁观者效应。旁观者效应不只能消灭肿瘤细胞，对肿瘤基质细胞、粒细胞、肿瘤血管也有杀伤作用。另外，旁观者效应没有太多选择性，无论细胞是否表达目标靶点，只要毒素的扩散能力、透膜能力比较强，所及之处皆带杀伤。内吞型ADC产品的作用机制如下图所示。目前已批准上市的ADC产品基本都是内吞型的。但这类产品也有一定局限性，包括符合内吞且过表达双重要求的抗原有限、抗体的肿瘤穿透能力弱、肿瘤细胞可以通过调节内吞过程中的各个节点实现耐药。
旁观者效应并不是抗体介导的直接内吞导致的，理论上毒素到达肿瘤微环境就有发挥作用的可能。所以，这就出现一种新的策略，采用直接靶向肿瘤特异性细胞外膜抗原、肿瘤基质成分或非内吞/少内吞的膜抗原的抗体，偶联毒素，也有抗肿瘤的潜力。当然，内吞和非内吞抗体在连接子方面还是有区别的，前者可切割或不可切割的连接子都可以，后者只能用可切割的连接子，而且最好是在肿瘤部位选择性切割。如果连接子不稳定，在外周血切割，一是会出现严重的毒性，二是到达肿瘤部位的有效药物浓度会降低。作用机制如下图所示。
靶向膜蛋白的非内吞型ADC
其实，非内吞ADC（或内吞比例非常低的ADC）已经有多个靶点在研，比如CD20、CD21、CAIX和FAP。此外，作用于细胞外基质组分的ADC靶点也有在研，包括fibronectin、tenascin-C、fibrin和collagen IV等。通常非霍奇金淋巴瘤通过化疗和抗体药物联合治疗后效果挺不错的，但复发后的肿瘤是需要新型治疗方式的，ADC是很有潜力的一类产品。尤其对于B细胞来源的非霍奇金淋巴瘤，细胞表面会特异性高表达各种抗原，如CD20、CD21、CD19、CD22。前两个抗原是非内吞型的，后两个则是内吞型抗原。Polson团队采用CD19、CD20、CD21、CD22、CD72、CD79b、CD180等抗原的抗体，采用可切割、不可切割两种连接子，偶联抗微管蛋白毒素分子，在小鼠中考察了抗肿瘤药效。结果显示，所有采用可切割连接子偶联的药物，无论靶点内吞与否，均产生了明显的抗肿瘤作用。采用不可切割连接子的药物，仅内吞型靶点，产生了药效。结论很明显，可切割连接子在胞外（非胞内）被切割后，释放毒素，通过扩散穿过细胞膜，发挥抗肿瘤作用。
碳酸酐酶是一类金属酶，催化二氧化碳水合生成碳酸氢盐。碳酸酐酶Ⅹ（CAIⅩ）是一类跨膜同源二聚酶，在90%以上的肾透明细胞癌中过表达。另外，大部分肿瘤内部是一个缺氧的环境，CAIⅩ是缺氧最好的标记物之一。同时，CAIⅩ在正常器官中的表达又是非常受限的。这就使CAIⅩ成为很有吸引力的ADC靶点之一。起初很长时间，CAIⅩ被视为内吞型抗原。最近已经研究清楚，CAIⅩ是个几乎没有内吞的靶点。Petrul通过将CAIⅩ抗体采用可切割的Val-Cit连接子偶联了MMAE毒素，制备得到ADC分子BAY 79-4620。临床前研究显示，BAY 79-4620在体外可选择杀伤CAIⅩ阳性肿瘤细胞，体内5和10mg/kg剂量下对结肠癌、宫颈癌等肿瘤模型也显示出不错的药效。2014年，这个分子进入Ⅰ期临床剂量爬升阶段，剂量为0.3-4.6 mg/kg。但是，12例患者无PR或CR出现，且高剂量出现心脏骤停和胰腺炎导致的患者死亡。当然，这个分子也就停止推进了。这一悲剧进一步提示，抗原表达分布情况对无论内吞型还是非内吞型ADC产品来讲，都是影响成药的关键因素。
锚定在肿瘤微环境中的抗原或在基质细胞表面的抗原也是非内吞ADC开发的候选靶点。在人体多个实体瘤中发现一个共同现象-纤维蛋白（fibrin）的血管外沉积。动物中也有同样发现，小鼠接种肿瘤后，纤维蛋白沉积往往是最早的形态学变化之一。基于此，Yasunaga团队开发了靶向纤维蛋白的ADC，偶联伊立替康活性代谢产物SN38，DAR值高达24。动物药效试验结果显示，13.3mg/kg，每周给药1次，可明显抑制肿瘤生长，反观伊立替康每天给药组则未见明显药效。毒理学研究未见该产品对肝脏、骨髓、肾脏功能的影响，动物耐受性良好。
成纤维细胞作为重要的基质细胞，在肿瘤转移、侵袭过程中发挥重要作用。成纤维细胞激活蛋白α是成纤维细胞分泌的一种丝氨酸蛋白酶，参与组织重塑和伤口愈合。Sibrotuzumab是一株FAPα抗体，给药后可24-48h可见在肿瘤部位的选择性分布。但是，单独的Sibrotuzumab没有抗肿瘤活性。Ostermann团队通过将FAPα抗体偶联美登素，在胰腺癌、非小细胞肺癌、头颈鳞癌和结肠癌中观察到明显的抗肿瘤作用。
成纤维细胞上还有一个抗原靶点-LRRC15（leucine rich repeat containing 15），在正常组织低表达，多种实体瘤如乳腺癌、骨肉瘤、前列腺癌中高表达。基于此，Abbvie开发了一款LRRC15的ADC产品-ABBV-085，通过ValCit偶联MMAE，已经完成了临床I期研究，27例肉瘤患者中，4例部分缓解，ORR为7.4%，8例疾病稳定。患者耐受性良好。
PD-L1这个靶点比较熟知的是开发成抗体药物，如Merck的avelumab、Roche的atezolizumab、AstraZeneca的duralumab，均已经在多个肿瘤适应症中获批上市。PD-L1这个靶点内吞与否与抗体结合的表位有关，avelumab在MDA-MB-231细胞中只有不到20%被内吞，atezolizumab内吞则达40%，但整体内吞效率都不算高。PD-L1可以作为非内吞ADC潜在靶点之一。
癌胚抗原细胞粘附分子5（CEACAM5）是许多肿瘤的生物标记物之一，同样具备不内吞的特点。Goldenberg开发的CEACAM5抗体ADC，采用的是对酸不稳定的连接子，毒素是SN-38。在人结肠癌、胰腺癌和淋巴瘤中看到了不错的药效。研究人员认为不稳定可切割连接子在酸性条件下使ADC缓慢释放SN-38，导致肿瘤局部游离药物蓄积的非内吞机制是发挥抗肿瘤作用的关键。
靶向肿瘤中经修饰的细胞外基质
除了膜抗原靶点，细胞外基质也是一类潜在可发成ADC产品的靶点。肿瘤细胞生长迅速，血管不规则，导致氧气供应和利用的不充分，形成缺氧微环境。肿瘤细胞在厌氧条件下会产生诸如CO2，H+-lactate等呼吸终产物，后者是导致肿瘤间质出现酸性环境的重要原因之一（pH从6.5-7变为6左右）。异常的pH值环境会诱导细胞外基质组分产生剪接异变体，如纤连蛋白和tenascin C。纤连蛋白是糖蛋白，是细胞与基质组分之间的桥梁，涉及细胞粘附、迁移、归巢、伤口愈合等功能。纤连蛋白中的EDB和EDA片段选择性在肿瘤中表达，正常组织中的纤连蛋白不含这一片段。Tenascin C是另外一个参与细胞结合的寡聚体糖蛋白，与纤连蛋白类似，也存在肿瘤特异表达的不同剪接体形式。纤连蛋白和tenascin C的结构如下，箭头所示为开发成抗体的区域。
L19、F8、F16、81C6分别是针对纤连蛋白EDB、EDA、tanescin C蛋白A1和D表位的抗体。放射性药物131I-L19和131I-F16已经被用于霍奇金淋巴瘤和头颈癌的临床疗效评估。临床试验中，也有用L19或F16融合细胞因子IL-2或TNF用于黑色素瘤、软组织肉瘤、B细胞淋巴瘤等的治疗。以上两个应用，核心还是利用了纤连蛋白和tenascin C的肿瘤特异性，通过抗体的肿瘤靶向递送能力，将核素、细胞因子直接运送到靶部位。
既然能携带核素、细胞因子，自然也能开发成我们今天的主角-ADC。当然，这些抗原的位置在可溶性蛋白中，自然就不涉及内吞一说了。有研究用EDA抗体F8偶联一种微管蛋白抑制剂cemadotin，采用的是C端半胱氨酸定点偶联，DAR值为2，小鼠中半衰期约为48h。体内抗肿瘤药效也很明显。但是，在剂量高达43mg/kg时，未见动物出现肿瘤消退情况。推测原因或许跟毒素有关，应该偶联活性更强的毒素，比如DM1。采用F8-SS-DM1 ADC产品给予接种F9畸胎瘤的小鼠，7mg/kg的剂量，给药3次，60%的动物出现肿瘤消退。也有团队用F16抗体偶联MMAE，采用蛋白酶敏感型连接子Val-Cit。F16-Val-Cit-MMAE在A431、U87人肿瘤中可引起肿瘤的完全消退。目前进展比较快的是针对EDB的非内吞ADC候选分子PYX-201，已经进入临床Ⅰ期研究阶段，并于2023年5月获得FDA孤儿药认定，用于治疗胰腺癌。
Galectin-3-binding protein（Gal-3-BP）在大多数肿瘤中均可发现大量且持续的分泌。Iacobelli团队制备了针对该靶点的ADC，在异源移植瘤动物模型中观测到不错的抗肿瘤药效，多只动物肿瘤完全消退。
LRG1是在肿瘤微环境中大量存在的糖蛋白之一。Chudasama团队开发了该靶点的ADC，采用了Val-Cit这一被cathepsin切割的连接子，毒素用的是MMAE。体外在LRG1阳性B16F10黑色素瘤细胞中，在cathepsin存在的情况下，显示出很强的肿瘤细胞杀伤作用。进一步体内研究同样显示出明显抑制肿瘤生长的能力，给出了与体外一致的结论。
除了以上靶点外，基质金属蛋白酶9（MMP9）、胶原蛋白、纤维蛋白也是不错的非内吞ADC开发靶点，并有临床前体内外药效学数据支持，不再一一赘述。
改善非内吞ADC产品的活性和选择性
组成ADC的三个组分，抗体、连接子和毒素，对产品的活性和选择性都有影响。对于非内吞型ADC，由于连接子是可切割的，而且是在胞外完成切割，掉落的毒素也是在细胞外，但是毒素需要进入胞内才能发挥作用，故更容易扩散透膜的脂溶性强的毒素是首选。另外，随着ADC连接子结构研究的深入，多聚连接子可以将DAR值提高到10以上，活性自然也随之增强，但带来的是潜在的免疫原性风险。当然，对于如何保障连接子在外周相对稳定，在肿瘤微环境选择性释放毒素是一项需要持续优化的工作。
最后
一直以来，对于一个靶点能不能开发成ADC，除了考量靶点在肿瘤组织中表达的特异性和丰度外，能否内吞也是核心指标之一。内吞型ADC一直是关注和研究的重点。但从过往数据看，非内吞型ADC在临床前的数据其实也已经得到充分验证。尤其纤连蛋白、tenascin-C这两个蛋白，其剪接体在肿瘤中大量存在，丰度很高，而且非常稳定，在大部分正常组织中几乎不表达，是药物递送的理想靶标。相对于研究火热的内吞型ADC，非内吞ADC的研究还比较少，但并不代表此路不通，只是因为内吞型ADC已有前路登顶，脚步可循，风险相对可控。随着研究数据的积累，非内吞型ADC或许也会迎来突破，打破内吞型ADC的垄断，也在某种程度上颠覆大家对ADC的一些认知。目前已经有非内吞型ADC推进到临床阶段，期待带来好的数据。
