随着各领域行业标准的升级，检测已经不可或缺。面对海量的检测需求、极短的检测时限，传统方法检测缓慢、要求高、操作复杂的短板已经越来越难以适应，新一代更快、更好、更方便的检测技术亟待研发。即时测试(PoCT)具有短耗时、高集成、操作简便等优点，同时又能保证准确度和一定的敏感度，在食品、检疫、医疗等领域都有广泛的应用。近年来，许多纳米材料被用于一种全新的纳米 PoCT方法，碳点(CDs)的应用就是其中之一。
CDs是一类新型的纳米材料，通常是小于10nm的零维纳米材料，一般都具有光致发光的特性。CDs的表面可以通过化学修饰附上大量官能团如羧基、羟基、胺基等，也可以吸附聚合物链如核酸等。CDs具有优异的光学特性、抗菌活性、生物相容性和生物安全性，在体内外测试中被广泛使用。
本工作就CDs各种独特的性质综述了其在生物检测方向的应用，为开发灵活、广泛的纳米材料PoCT平台提供信息。
1、可用于核酸检测的CDs制备和表征
1.1 CDs的制备
CDs可通过多种方法制备，不同的制备方法决定了CDs的微观结构、大小和量子产率。CDs的来源丰富，以食物为碳源的食源性CDs也常常受到关注。QIN等以面粉为原料，微波辅助快速、绿色制备CDs，将Hg2+的检出限进一步下降至 0.5nmol·L-1；YAVUZ等由甜菜糖蜜制备CDs，粒径为1.3~3.8nm；WANG等以大豆为原料制备了蓝色荧光CDs，量子产率为4.46％；JOTHI等使用米糠制备了自钝化的亮绿色荧光CDs，量子产率为7.4％。
CDs的制备一般分为自上而下和自下而上两种方法。
1.1.1 自上而下的制备方法
CDs的自上而下制备方法通常是以碳纳米管、碳纤维、石墨、活性炭等宏观 含碳物质为原料，通过物理或化学方法分解至纳米级而得到。由于分解物质所需条件苛刻，反应常在高热、强酸等极端环境下发生，制备过程较为繁琐。2004年，XU等在对荧光单壁碳纳米管(SWCNT)的碎片进行电泳分析和纯化时偶然发现了一种荧光碳杂质，并首次提出了CDs这种纳米尺度的物质有望作为新的纳米材料而得到应用。他们通过电弧放电法从SWCNT的粗烟灰中分离得到CDs，但此种方法得到的CDs难以纯化，量子产率也不是很高。2006年，SUN等通过激光烧蚀法(LA)制备了荧光CDs，该方法可以产生较为纯净的CDs，量子产率也提高至4％~10％。产生的荧光CDs在固定激发波长的光照下能够呈现多种波长的发射光，该方法也逐渐成为目前常用的CDs自上而下制备方法。2020年，KANG等使用脉冲LA一步制备掺硫石墨烯量子点，这种CDs的量子产率为3.89％，光学性能得到了很大的提升。CALABRO等通 过液相 LA制备石墨烯量子点，并与化学氧化法进行了比较，认为液相LA能够减少化学药品用量，且副产物较少，从而使更快、更绿色制备石墨烯量子点成为可能。
电化学或化学制备法能在保证一定量子产率的条件下，实现CDs的表面功能化。在常压和常温下，CDs可通过强氧化剂以氧化还原反应的方式制备，这样的制备方式能在一定程度上控制CDs的颗粒大小，将氨基、羧基、羟基等功能基团修饰到CDs上，故上述制备方式常常被用于纳米生物传感器的制作。
超声波是一种波长极短的机械波，具有较强的能量。利用超声波的机械破碎性 质制作CDs仅需要氧化剂和超声波设备，故被认为是一种简单经济的制备方法。PARK等将食物垃圾的乙醇溶液用40kHz超声波处理45min后离心，得到了绿色荧光的CDs。但当在有氧环境下超声处理 CDs时，附着在CDs上的荧光会因强烈的氧化作用而猝灭，导致量子产率的急剧下降，仍需要进一步使用水热法以形成新的荧光基团。
1.1.2 自下而上的制备方法
热分解法是目前最有可能实现大批量CDs工业化生产的制备方法之一。它通过加热裂解含碳前体，在短时间内大量产生 CDs。工业化生产中可以通过控制反应的酸度、温度、回流时间、碳化度等来控制CDs产物的荧光特性。MA等建立了一种以乙二胺四乙酸(EDTA)为前体通过热分解法制备石墨烯量子点的方法，该方法操作简单、无溶剂、前体耐受性强、反应时间短、成本低和可扩展生产。此外，以柠檬酸为前体的CDs也可以使用热分解法进行制备。
水热法是指通过水热碳化(HTC)技术制备CDs，是目前最常用的CDs制备方法。该方法是将有机前体密闭于高温高压容器中进行一定时间的碳化。水热法制备的CDs在紫外光的照射下能够显示出多种稳定的发射荧光，荧光发射的波长和所使用的有机前体具有一定的关系。一步水热法最早建立于2013年，GUO等利用柠檬酸钠和碳酸氢铵一步制备了荧光碳量子点，将CDs制备的量子产率提高至68％。
微波可为前体分子中化学键的断裂提供能量，常常与热分解法或水热法联用。ROMERO等将微波法和水热法结合制备 CDs，YU等将微波法与热分解法结合制备酸度敏感的绿色CDs。
模板法制备CDs一般包含两步：①在模板中煅烧制备所需的CDs；②蚀刻去除支撑物。LIU等以二氧化硅微球作为模板载体，以甲阶酚醛树脂为前体，2mol·L-1氢氧化钠溶液蚀刻48h除去二氧化硅微球，制备了多色CDs，量子产率为14.7％。
1.2 CDs探针的功能化设计策略
1.2.1 核酸包被的CDs探针
使用核酸包被纳米材料是近年来 PoCT技术的新趋势，一些研究表明核酸能够通过氢键、π-π堆叠或疏水作用与 CDs相互结合，从而被连接在一起。GARCÍAＧMENDIOLA等基于CDs开发了一种一次性电化学DNA生物传感器，用于识别聚合酶链式反应(PCR)样品中的基因突变，该CDs通过乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)热分解法制备，能够有效固定DNA并保持其杂交能力。MILOSAVLJEVIC等以柠檬酸作为碳源，以聚乙二醇(PEG)作为封端剂，增强了CDs的光学性能和化学稳定性，将 DNA与 CDs溶液混合制备得到了CDs＠DNA复合物，并对其进行了电化学、光学以及电泳性能的表征。
虽然单链DNA能够通过简单混合的方法固定到富含羧基的CDs表面上，但这种固定方法不是牢固而不可逆的。WEI等用单链DNA包被CDs，利用单链DNA与丙烯酰胺(AM)的高亲和力使其与CDs产生竞争，当样本中存在AM时单链DNA优先与AM结合，将其从CDs中争夺下来，从而暴露CDs产生荧光。这种竞争性“关-开”的发光机制，或许可以通过对比检测对象与核酸探针、核酸探针与CDs之间作用力大小进行预测，从而用于更多的检测方法中。
1.2.2 杂原子掺杂的CDs探针
杂原子掺杂能够通过改变CDs固有的电子特性、增加表面活性位点来调节和改善CDs的荧光特性，这在细胞成像和微生物检测等微量分析中非常重要。为了获得更好的生物成像效果以及更高的荧光强度，氮和硫原子常常被掺杂进CDs中。LI等以尿素和半胱氨酸为碳源、氮源及硫源，采用水热法制备氮硫掺杂的CDs，并测定菇类食品中维生素B2，检出限达到5.0×10-8mol·L-1。WEI等以水热法制备了氮硫掺杂的CDs，其光致发光性能在不同的酸度、高含量氯化钠和不同金属离子的环境中均稳定保持，能被用于MCF-7和K562细胞质中的多色成像。ROMERO等采用化学氧化法制备氮硫掺杂的CDs，并用于废水中高碘酸根的检测，其量子产率达到22％，这甚至超过了一些水热制备的成像用CD。LIU等利用氮硫掺杂的CDs完成了对酸度和温度(10~70℃)的传感，并建立了一种定位于 细胞核的RNA选择性成像技术，进一步对氮硫掺杂CDs与DNA或RNA的亲和力进行了比较，发现氮硫掺杂可以使CDs特异性结合RNA而不是DNA，这一发现能被用于基于CDs的RNA特异性探针的设计。
其他杂原子的掺杂也能够改变CDs的 光学特性和检测对象特异性，例如磷氯掺杂的CDs能够特异性检测Fe3+，氮磷掺杂的CDs能够在血清和尿液中检测Cd2+。环境因素也能改变CDs的检测性能，由于水热法合成的CDs表面能够通过共价键连接丰富的羧基、酚羟基等酸性基团，它们可逆的质子化和去质子化造成了电子能级的变化，并直接导致了CDs荧光性质的改变。氮氟掺杂的CDs在pH13时能够检测硅，而在pH8时则能够检测汞。利用酸度对杂原子掺杂CDs的影响，路雯婧等合成了pKa为5.32的铁掺杂CDs，能够通过荧光强度的变化线性地检测细胞内 pH在4.4~6.2内的变化。温度变化也能够通过热力学的粒子效应影响CDs的荧光性质，当温度上升时粒子振动增加，碰撞频率增加，当CDs相互靠近时其荧光会被淬灭，体系中的荧光强度也会相应下降。陈文静等合成的氮硫掺杂的CDs利用这一原理，在20~55℃内通过测量415nm处的荧光强度来线性反映温度的变化。
诸多文献也提示其他杂原子掺杂能够调节和改善CDs荧光特性，如磷、氮、硫、硼等。结果发现CDs的光学性质和检测对象特异性能够通过表面杂原子修饰的方法进行优化，不同的原子掺杂可以给CDs增添不同的检测对象和功能，酸度等环境因素也能够影响CDs和检测对象之间的互相作用。
1.3 CDs的表征技术
与其他的纳米粒子表征方法相同，CDs的粒子形貌一般通过原子力显微镜(AFM)、透射电子显微镜(TEM)等手段进行表征。
AFM是一种利用探针尖端与样品表面相互作用而成像的显微方法，可提供CDs的二维和三维图像。TEM利用电子束与 CD样品相互作用产生的散射来生成明暗图像，以观察CDs的粒径。DONG等制备了抗菌量子点,并用AFM和TEM的方法进行了表征，结果显示CDs的高度约４nm，粒径约５nm,在二维图像中呈圆形。
部分具有荧光性质的CDs常常需要对其光学性质进行表征。傅立叶变换红外光谱(FT-IR)是一种常见的化学结构分析方法，制备后的CDs可通过这种方法进行表征，获取其表面的化学基团信息，从而决定之后的修饰方式。MEHTA等通过FT-IR分析制备的CDs得知其表面有丰富的O-H、C-H、C＝O、C＝C、C-N和C-O 基团。X射线晶体衍射结果表明其中含有湍层碳和石墨碳。
紫外-可见吸收光谱法以及荧光光谱法也常被用作CDs的表征手段。根据 MEHTA等的表征结果，制备的CDs的紫外可见光吸收波长为250nm和300nm，荧光激发波长为368nm，荧光发射波长为475nm。
对于多色量子点，也可以通过紫外吸收峰的位置进行区别。JIANG等制备了红绿蓝3色的光致发光CDs，并采用紫外-可见吸收光谱法对制备的荧光量子点进行表征。3种CDs的紫外-可见吸收光谱显示其吸收峰位置类似，表明其具有类似的性质，并在不同波长处具有各自的荧光发射。
2、基于CDs的PoCT方法的应用
2.1 食品安全
食品的各个生产环节都有污染的可能，原料质量不佳、农药残留、违规添加、掺假等现象是较为常见的食品安全问题，严重影响消费者的健康，因此快速的 PoCT方法亟待建立。
有机磷类化合物如甲基对硫磷、草甘膦、敌敌畏等是常用的一大类农药，微量的有机磷农药就能导致严重的肠胃道反应、脏器衰竭甚至死亡，目前还没有针对有机磷农药有效的解毒剂，其在食物中的残留越来越得到人们的关注。LI等以巯基乙酸单乙醇胺为前体制备氮硫共掺杂的 CDs，用于检测苹果表面的甲萘威。WANG等采用微波辅助热解工艺由羊毛制备CDs，量子产率达到16.3％，并成功在谷物样品中完成草甘膦的检测。敌敌畏是一种广为人知的农用杀虫剂，曾被大量用于农业而导致严重的农药残留。敌敌畏是乙酰胆碱酯酶(AChE)的不可逆抑制剂，会导致突触间隙内乙酰胆碱的含量升高，产生尼古丁和毒蕈碱症状，死亡率极高。HOU等使用季铵化CDs构建了一种量子产率高达34.2％的荧光共振能量转移(FRET)敌敌畏传感器，并在卷心菜和果汁中进行了验证。
原料检测是保证食品安全的重要环节，如水的检测等。ZHOU等将CDs作为纳米探针检测复杂基质如湖水中的Hg2+和生物硫醇。韩爱霞等利用废弃的 豌豆荚作为碳源，合成了能被Hg2+高效淬灭的氮掺杂CDs，并得到了线性的荧光滴定工作曲线。硅烷修饰的CDs具有与氮 掺杂相似的性质，一些硅烷修饰的CDs也能够检测Hg2+ 、Fe3+和Cr(Ⅵ)。这些研究提示了相似原子修饰的CDs可能具有相似的检测功能。邻苯二甲酸二丁酯是一种塑化剂，常被用于生产聚氯乙烯材质的各种食品药品包装，它不易与塑料共价结合而进入食品中造成污染。邻苯二甲酸二丁酯是潜在的致癌物，也具有生殖毒性，孕妇暴露于邻苯二甲酸二丁酯环境中易导致新生儿体重降低。徐志祥等用水热法以抗坏血酸前体制备CDs，随后与胺化的核酸适配体连接，制备了双发射CDs标记核酸适配体，通过荧光比值法建立了食品中邻苯二甲酸二丁酯的超灵敏快速检测方法，并以此申请了专利。LIU等将CDs与 MnO2纳米片结合作为检测抗坏血酸的荧光探针，检出限达42nmol·L-1。付海燕等采用水热法制备碳量子点，利用其荧光性质检测食物中的掺假淀粉，并在咖啡中进行了验证。
目前CDs常用于金属离子的检测，在食品安全方向的应用较少，多集中于化学检测而缺少生物检测。检测对象也偏重于水源、果蔬、包装等组成成分单一或无需复杂加工的食品或食品包装。对于加工后食品样本的检测研究较少，这可能是由于复杂的食品加工方法使得样本的组成增加，一种CDs可能会结合多种靶标，导致严重的假阳性结果，从而使检测特异性 降低，无法满足食品安全检测的需要。因此，CDs的功能化方法及其检测对象的分类归纳、机制的研究就显得非常重要，这或许是成功预测CDs表面修饰和检测对象之间联系的突破口。
2.2 检疫与临床检测
检疫是防止疾病传播、物种入侵的重要手段，随着海内外贸易的不断发展，快速准确的检测方法亟待建立。CDs是一种便于制备、经济、绿色，具有PoCT潜力的新型纳米材料,常被应用于微生物标志物的即时检测。CHEN等利用EDTA采用水热法制备了量子产率高达43.6％的 CDs，将铽以配位键的方式结合到CDs上，对CDs进行功能化，上述用铽原子功能化的CDs可以特异性结合炭疽生物标志物2,6-吡啶二羧酸(DPA)。RONG等以氯化锰和柠檬酸为原料，采用热解法制备蓝色荧光的锰掺杂 CDs(Mn-CDs)，将上述 CDs滴在圆形滤纸上后干燥，得到的荧光试纸也可以特异性结合DPA。该试纸在紫外灯下能用智能手机软件拍摄成像定量，检出限为1μmol·L-1。在研究上述Mn-CDs时还发现，当锰的掺杂量上升时，CDs的量子产率也逐渐增加，当锰掺杂达到25％(质量分数)时，Mn-CDs的量子产率达到最大(13.5％)，相较于掺杂 前 的 8.3％，具有显著的增强效果。参考CHEN和RONG等的研究，ZHOU等用同为镧系元素的铕替代铽对CDs进行功能化，也能够用于检测 DPA。用上述铕掺杂的CDs设计了双比例光学探针，建立了DPA的比色和荧光视觉检测方法，检出 限分别为10.6nmol·L-1和1μmol·L-1。上述研究发现，镧系元素功能化的CDs都能够特异性识别DPA，并且具有近似的检出限，这再次提示了用相似元素对CDs进行功能化可能能够使其具有类似的检测功能。
流行病病原体也是检疫重要的检测对象。WANG等以CDs与核酸适配体结合定量检测鼠伤寒沙门氏菌，检出限为50CFU·mL-1。以抗原和单克隆抗体为基础衍生出的免疫分析技术现已成为PoCT的主流，在此次新型冠状病毒疫情中发挥了重要作用。选用富含氨基的碳源合成的氨基化CDs能够结合酰胺化的蛋白，张春林等利用氨基葡萄糖合成氨基化CDs，采用化学偶联法将其与大肠杆菌抗体连接，相同的方法也有望用于CDs与抗原的连接，以提供更快速、易于获得的抗原试剂盒。
作为PoCT的一种应用，床边检测逐渐成为临床检测方向的新趋势。CDs的快捷性、简便性使其在血液检查中非常受欢迎，同时其较小的分子尺寸、良好的生物相容性、低毒性和强荧光性质使其成为一种良好的生物成像材料。
镉被广泛用于各种工业制品的生产中，它不是人体的必需元素，从被污染的空气、水和食物中摄入过量的镉会引起镉中毒。镉中毒的常见临床表现为贫血、肾脏损伤，骨质中的钙被镉置换引起骨软化和骨质疏松，严重时能够导致骨折和痛痛病。此外，镉中毒还有潜在的致癌风险。为了避免从水源摄取过量的镉，NIU等设计了由CDs与金纳米团簇(AuNCs)组成 的纳米杂化物，以测定湖水中的镉，通过组氨酸和丙氨酸水热法制备发蓝色光的 CDs，用11-巯基十一烷酸(MUA)封端的发红色光的AuNCs对其进行功能化，从而特异性识别镉离子，此外该CDs还能够检测人血清中的抗坏血酸。裴元生等用 CDs修饰玻碳电极后镀铋膜，用于检测地下水中镉和铅，质量浓度为0.25mg·L-1时能报告非常高的峰电流。刘意等利用 氮硼共掺杂的CDs检测溶液中的镉，利用荧光增强效应准确建立了光强与镉含量的关系，为镉定量检测提供了新思路.HUANG等将氮钴共掺杂的荧光磁性 CDs作为人体血清中胆固醇和尿酸的比率荧光探针，可作为快速的临床诊断方法。CHELLASAMY等将CDs荧光检测与智能手机结合，通过智能手机上比色传感器阵列阅读系统对老年人血浆中的多巴胺进行检测。
CDs具有良好的生物相容性和低毒性。XU等通过水热法制备碳量子点以稳定钆纳米探针，可作为核磁共振成像(NMRI)的造影剂，也能通过荧光成像。ZHANG等使用干酵母微波热解得到绿色的发光CDs，并进行叶酸功能化来对叶酸受体阳性的癌细胞进行成 像。KALYTCHUK等使用氮硫掺杂的CDs光致发光的寿命推算被测细胞的温度，为癌症热疗提供了准确的组织温度测量方法。新成像技术是诊断医学关注的热点目标，CDs可以通过口服或注射的方法进入体内并被运送到病灶处进行显影。NIU等利用蛋白质ＧCDs在大脑中有着显著的成像效果来检测早期的血脑屏障损伤，并估计溶栓后症状性颅内出血的情况。DAS等使用聚乙二醇辛基苯基醚作为结构导向剂，以吡咯和苯胺为前体，制备了氮掺杂的CDs，它能够在实现荧光成像的同时具有良好的光热效应，在980nm近红外光下诱导人口腔癌细胞发生热消融效应，既能够完成检测又能够准确可控地杀灭癌细胞，是一种新颖的癌症热疗方法。此外，将CDs添加入组织再生支架中，在维持支架机械强度的同时，还能增加其抑菌和监测能力，一些添加了CDs的支架材料还具有诱导组织增殖和定向分化的作用。
3、总结与展望
作为一种新型的纳米材料，CDs便于制备、生物相容性好、环保低毒，同时 CDs的荧光、光热效应显著，且易于与其他固相载体连接，因而被广泛应用于各类 PoCT方法中。CDs能够通过多种途径制备，其中水热法制备的CDs色彩多样、量 子产率高、表面易于功能化。杂原子掺杂的CDs具有更好的量子产率，掺杂了同一类元素的CDs有较为近似的性质，但具体机制仍未可知,有待进一步研究。此外，CDs作为造影剂，相对分子质量较小，能够穿过血脑屏障完成脑中成像，有利于脑科疾病的预防和诊断。
目前CDs的成像多应用于体外培养细胞或裸鼠注射试验，并得到了较好的结果。CDs的合成成本低、应用面广，但目前主要的合成方法停留在实验室阶段，大批量的工业合成仍然没有实现。已知的合成方法中热分解法和水热法是最便于合成、量子产率最高的方法。通过扩大合成规模，优化和筛选各个步骤在放大试验中的条件改变，参考其他纳米材料的生产线进行调整和适应，或许是解决CDs工业化生产的好方法。CDs通常具有较低的生物毒性，但进入细胞内的CDs仍有可能导致细胞死亡，这主要是因为被细胞内化的 CDs可能会诱导细胞产生光致损伤或催化活性氧(ROS)的过量产生，导致细胞氧化应激，如何钝化或如何功能化CDs以有效降低其生物毒性值得深入研究。前期不少研究也发现杂原子掺杂的CDs具有多种多样的性质，但CDs检测对象的筛选往往是通过偶然发现或比对淬灭效果筛选得到的，效率低、普适性差。因此，CDs特异性检测的具体机制亟待研究，通过比较相似杂原子掺杂CDs的化学结构来进行功能归类，可能实现检测功能的预测。现今高通量也逐渐成为PoCT方法追求的热点,多色CDs的合成和应用也为其高通量检测方法的诞生奠定了良好的基础，适用于普通打印机的CDs墨水也扩展了CDs的应用方式。随着对CDs制备方法和功能机理的进一步研究，CDs的应用将越来越多样化，更多基于CDs的PoCT检测方法值得期待。
作者：高家乐1，钮冰1，陈沁1，王艳2
单位：1.上海大学 生命科学学院；
2.上海海关 动植物与食品检验检疫技术中心
来源：《理化检验-化学分册》2023年第9期
