当血流通过动脉受到限制时，就会发生严重的肢体缺血（CLI），导致下游肢体溃疡、坏死和慢性伤口。侧枝小动脉的发育(即动脉生成)，无论是通过重塑已有血管网络还是新生血管的重新生长，都可以预防或逆转缺血性损伤，但刺激侧枝小动脉的发育仍具有挑战性。多因子策略虽然有着一定的效果但其临床转化的途径变得复杂。因此，研究者开发出了具有模拟可溶性蛋白质活性的结合肽的水凝胶。
近日，来自美国范德比尔特大学的Ethan S. Lippmann团队设计了一种新的肽功能化水凝胶用于CLI治疗。该研究使用明胶作为水凝胶骨架，用来自1型钙粘蛋白胞外结构域的肽将明胶功能化，将其称为GelCad，然后使用支链胺反应性聚乙二醇(PEG)聚合物原位交联成水凝胶。研究表明，在使用再生能力有限的小鼠的严重股动脉结扎模型中，GelCad水凝胶在体内强有力地促进侧支小动脉的发育，并防止缺血性损伤。
相关研究成果以“Growth factor free, peptide-functionalized gelatin hydrogel promotes arteriogenesis and attenuates tissue damage in a murine model of critical limb ischemia”为题于2023年11月13日发表在《Biomaterials》上。
1. 钙粘蛋白肽偶联明胶的合成与表征
基于之前的合成策略，作者进一步使用EDC/NHS反应将肽结合到明胶上，利用核磁证实了明胶上肽的存在(图1A)。通过流变学、原子力显微镜和扫描电子显微镜测量，两种交联策略都产生了柔软的多孔水凝胶(图1B–E)，其基本性能适用于体内使用。
图1 GelCad水凝胶的表征
2. GelCad水凝胶促进平滑肌细胞向血管结构的募集
先前的工作表明，血管损伤后SMC中的N-钙粘蛋白表达上调，并调节SMC增殖，假设明胶中钙粘蛋白模拟肽的存在会增强SMC对血管结构的募集，从而促进小动脉的形成。为了评估这种可能性，作者将小鼠大脑皮层匀浆，暴露血管并模拟损伤情况。然后，将这种离体组织包埋到mTG交联的明胶、GelCad或“GelScram”水凝胶中(后者含有钙粘蛋白肽的混杂版本)。如⍺-SMA信号所示，相对于任一对照，包埋在GelCad水凝胶中的组织在24小时后在凝集素+血管样结构上具有显著更高的SMCs覆盖率(图2)。
图2 GelCad水凝胶促进离体组织样品中平滑肌细胞募集成血管样结构
3. 在注射到乳房脂肪垫后评价GelCad水凝胶中的小动脉发育
接着，为了建立该研究的体外结果，作者接下来检查了PEG交联水凝胶在C57BL/6小鼠乳腺脂肪垫中的性能。水凝胶注射后，首先使用对比增强超声检查血管发育。在注射后第7天，可以在明胶和GelCad水凝胶的内部检测到大血管，在GelCad样品中可能有更多的血管(图3A)。然而，很难量化血管特征，因为水凝胶和周围组织之间的绝对边缘必须被估计和手工绘制。为了解决这个问题，作者分离了完整的水凝胶用于冷冻切片和免疫组织化学。在GelCad水凝胶中，可以容易地在水凝胶中定位大量α-SMA+血管，指示小动脉形成，而在明胶水凝胶中，可以定位一些假定的小动脉，但是α-SMA信号强度低得多(图3B)；总小动脉数量的量化揭示了显著差异(图3C)，这反映了在图2中的离体数据。
然后，作者使用Vesselucida软件追踪和量化水凝胶中的血管特征(图3D)。在明胶和GelCad水凝胶中，可以检测到直径范围从50到350微米的血管，表明有小动脉。在GelCad水凝胶中，分支结的数量(表示血管分支点)和血管体积(表示血管网络的大小)明显更高。总之，这些结果进一步表明GelCad水凝胶增强了小动脉的发育。
图3 在小鼠脂肪垫中注射后评价GelCad水凝胶中的小动脉发育
4. 在严重肢体缺血的小鼠模型中评价GelCad水凝胶的功效
作者在CLI的股动脉结扎模型中评估GelCad水凝胶平台的治疗潜力。在14天的时间里，我们评估了用明胶、GelScram或GelCad水凝胶治疗的小鼠以及接受生理盐水的假对照小鼠的血流量、活动性和组织质量的恢复情况。与所有其他条件相比，用GelCad水凝胶治疗的小鼠在结扎的肢体中有明显更少的坏死；接受明胶水凝胶或盐水的小鼠通常在第7至14天因严重坏死而失去肢体，这突出了该模型的严重性(图4A和B)。使用Tarlov活动性指数，作者还确定了接受GelCad水凝胶的小鼠在7天后活动性恢复，而接受明胶水凝胶或盐水的小鼠从未恢复活动性(图4C)。
图4 股动脉结扎和水凝胶递送后小鼠的物理外观和活动性
这些结果反映了LDPI测量，其中接受GelCad水凝胶的小鼠在14天内具有接近完美的灌注恢复(与健康腿的比例为1∶1 ),而用明胶水凝胶或盐水治疗的小鼠没有表现出灌注恢复(图5A和B)。为了进一步证实侧支发育，再次用不透射线的聚合物灌注小鼠，进行μCT成像，并使用Vesselucida软件追踪和量化健康肢体与用GelCad水凝胶治疗的结扎肢体的血管网络。尽管结扎肢体缺乏通过股动脉的血流，但结扎肢体的总血管长度与健康肢体大致相当，且血管直径无显著差异(图5C-E)——这些数据表明通过增加侧枝密度来补偿血流。
图5 股动脉结扎和水凝胶递送后灌注的恢复
最后，作者使用半定量指标对肌变性、肌坏死、骨细胞损失、中心核、纤维化和骨髓坏死进行了组织病理学评估(图6)。相对于所有其他条件，用GelCad水凝胶治疗的小鼠具有明显较轻的肌肉退化以及肌肉和骨髓坏死。在用GelCad水凝胶治疗的小鼠中，坏死几乎完全不存在，但在所有其他情况下，坏死普遍存在。此外，在用GelCad水凝胶治疗的小鼠中没有观察到骨细胞损失，而在其他条件下有轻微损失。因此，GelCad水凝胶防止由缺血性损伤引起的组织变性，可能是通过侧枝发育快速恢复血流。
图6 接受不同水凝胶治疗的结扎后肢的组织病理学
在这些阳性结果的支持下，作者选择了两只接受股动脉结扎和GelCad水凝胶治疗的小鼠，并将其老化5个月，以评估治疗反应的长期持久性。在最后，小鼠具有正常的行走，并且在结扎的肢体中没有可见的坏死迹象(图7A)。LDPI成像显示在结扎的和健康的肢体之间有接近1∶1的灌注比，表明侧支网络的强健和对来自股动脉的减少的循环的持续补偿(图7B和C)。
但是在μCT图像中对侧枝网络的追踪揭示了总血管长度的潜在增加，而不是血管直径的增加，这潜在地暗示了在这个延长的时间点上新侧枝血管的生长(图7D–F)。因为可以认为GelCad水凝胶产生了这种持久的反应，未来的工作将集中在分析这些延长的时间点，以更好地了解侧枝发育的长期机制，作为这些水凝胶的功能。
图7 股动脉结扎和用GelCad水凝胶治疗后5个月的小鼠的评价
综上，这项研究中评估了钙粘蛋白肽功能化明胶水凝胶的动脉生成活性。作者确定了该肽在将SMCs募集到血管中起着关键作用，这促进了体外和体内小动脉的发育。在一个严重的CLI模型中，GelCad水凝胶有助于血流恢复，并在数月内防止缺血性组织损伤。总的来说，该研究表明GelCad水凝胶在CLI和其他有益于侧支小动脉发育的情况下具有很好的治疗潜力。
文章来源：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2023.122397
