单克隆抗体（单抗）药物已经成为市场上增长最快的一类治疗药物，但开发用于治疗的单抗仍然具有挑战性。此文从制剂开发角度，根据单抗序列分析、高通量实验性评估综述了单抗药物早期成药性研究策略，旨在为筛选鉴定出易于生产及稳定的候选治疗性单抗药物提供参考。
自1986年全球首个单克隆抗体(单抗)药物OKT3问市以来，单抗就在生物制药中占有重要地位，并逐渐成为生物医药领域发展的主要方向，长期占据全球“超级重磅炸弹”药物榜单，在癌症、自身免疫性疾病和病毒感染治疗等领域应用广泛[1-2]。分离高效、广谱人源化单抗方法的出现，使我们能够开发出高活性的抗体药物[3]。
在单抗药物开发早期，能及时识别出影响单抗药物成药性的指标是非常重要的[4]。前期需要对病毒靶点进行筛选，对选出的靶点进行抗体库的构建，通过活性的筛选，得到抗体的可变区序列，对序列进行分析，选取等电点（isoelectric point，pI）合适、翻译后修饰（post-translational modification，PTM）少的序列，进行瞬时表达获得一部分抗体，然后进行进一步的体外生物学活性分析，包括抗原-抗体结合活性、病毒中和活性、阻断活性等，筛选出目标分子，必要的时候可引入体内药效评估。另外抗体能够被开发成药，还需具备一定的溶解度和稳定性，两者均属于抗体制剂开发角度的成药性研究范畴。在早期候选单抗分子筛选过程中需从生物制剂开发的角度对单抗的成药性进行综合评价，以提高后期候选单抗开发成功的可能性。
早期成药性评价是从已知单抗的序列出发，评估候选单抗的互补决定区（complementarity determining region，CDR）中潜在的 PTM 位点对未来药物安全性、有效性以及生产工艺产生的影响，而高通量试验性评估主要通过试验对单抗的胶体稳定性、构象稳定性和血清稳定性等进行评估。本文对抗体药物开发成药性进行介绍，以期为单抗药物开发提供借鉴。
1、单抗序列分析
在获得单抗序列后，应首先进行序列分析，包括pI、PTM位点等，以进行初步的成药性评估[5]。选择pI易于进行生产工艺开发的、PTM位点较少的序列，必要时可对高风险氨基酸位点进行点突变（如将Asn残基突变为Gln以防止糖基化），以减少后期制剂开发过程中可能会面临的问题[6]。
1.1pI预测
一般根据氨基酸序列，可以通过计算机模拟的方式估算出单抗的pI。pI对基于细胞表达的单抗的后期纯化工艺和制剂处方开发影响较大，而且抗体分子带电性的变化可影响其在体内与细胞表面受体识别与结合，从而影响抗体在组织、血清中的分布和代谢特征，因此对候选单抗的pI进行预测很重要。pI低的抗体药物，组织摄取时间增加，清除率降低，体内半衰期延长，清除率与pI呈正相关[7-10]。基于氨基酸序列计算出的单抗理论pI和实测值有时会有差距，这是因为一些PTM（如糖基化、磷酸化、甲基化等）、可变剪切以及蛋白降解等会影响单抗的pI。有研究对9个单抗的理论预测pI和实验测得的pI进行了比较,相差可达±1[11]。我们也对2株抗新型冠状病毒单抗X和Y的理论pI和实测pI进行了比较，根据单抗序列查询可知：X的理论pI为8.46，Y的理论pI为8.32，2株单抗的pI实测值X为8.35、Y为8.39，理论值与实测值相差分别为0.11和-0.07，均在±1的范围内，理论值可满足早期成药性评估的需求。因此，在早期成药性评价时，基于序列进行pI理论预测是可行的。从成药性角度对已上市的抗体分子pI进行统计分析，发现大多数抗体类分子pI高于7.5。为了降低抗体纯化、开发的难度，同时结合抗体在一定pH范围内远离pI的pH条件下，能保证较高的溶解度和减少聚集的特性，候选单抗分子的pI还应远离生理条件的pH，以降低生产、给药风险。
1.2PTM
蛋白质前体在PTM之前是没有活性的，只有在进行进一步的PTM加工和处理后，才会具有相应的生物学功能。单抗的PTM影响着抗体的正确折叠、空间构象和功能结构。PTM是一个复杂的过程，比较常见的为糖基化、二硫键形成、脱酰胺、氧化、甲基化、磷酸化等。通过对候选单抗CDR的氨基酸序列进行分析，寻找出潜在的PTM位点，并对可能影响单抗生产、制剂开发、稳定性以及生物学活性的位点进行风险评估。在PTM分析过程中，应首先对各个抗体序列进行计算分析，以判断是否存在游离Cys和N-连接糖基化位点，然后进一步分析脱酰胺位点和异构化位点，必要的时候还应通过基因工程手段进行改造，以满足单抗成药性的要求。
1.2.1 糖基化修饰 抗体分子是一种糖蛋白，糖基化对抗体的生物学功能是十分必要的[12]。糖基化是抗体药物关键质量属性之一，糖基化修饰对抗体的疗效、安全性以及药物代谢动力学等方面有着巨大的影响。糖链通常修饰于抗体分子Fc段CH2亚结构域上，全人源或人源化的IgG单抗N-糖基化修饰位点位于CH2区297位Asn上，该基序为Asn-Xaa-Ser/Thr（Xaa为除Pro外的所有氨基酸残基）。也有少数N-糖基化位点位于抗体Fab段亚结构域中[13]。除N-连接的糖基化外，极少数单抗药物中也存在O-连接的糖基化。O-糖基化多发生在临近Pro的Ser或Thr残基上，位点处的蛋白质多为β构型。基于抗体分子氨基酸序列的一级结构，即可推测潜在的糖基化位点。尽管并不是所有这些位点在生产时均会被糖基化，但后期生产过程中仍然可能改变这些位点的暴露状态，继而改变糖基化状态，从而影响其结合活性和药代动力学特性。已有研究表明，带有高甘露糖型聚糖的IgG在血清中的半衰期较短[14]。在CH3结构域中被额外糖修饰的IgG能够更有效地与新生儿Fc受体结合，从而延长半衰期[15]。Fc区聚糖可以通过改变Fc区的构象或通过聚糖-聚糖相互作用直接影响IgG与Fcγ受体的亲和力，从而强烈影响其招募免疫效应细胞的能力[16-18]。另有研究表明，Fc区糖基化有助于维持分子的稳定性，酶切截断或去除Fc聚糖的IgG显示出热稳定性、补体结合能力和细胞依赖性细胞毒性效应降低[19-20]。因此，在早期成药性评价中，研究、调整和控制单抗药物的糖基化水平显得十分重要。
1.2.2 二硫键配对分析 巯基在体内会形成二硫键，二硫键在单抗的热力学稳定性和正确折叠中起着非常重要的作用。一般而言，单抗具有4对链间二硫键和12对链内二硫键，用来维持单抗结构的稳定性，以抵抗各种有害影响。但单抗由于本身结构的复杂性，并不是所有的Cys都会形成二硫键，因此会造成Cys在体内的错配，准确预测二硫键对于确定单抗的理化特性至关重要。二硫键的存在和形成机制可以通过分析单抗的分子结构或通过水解消化，然后进行基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱分析预测[21]；也可以基于氨基酸组成对二硫键的预测，预测模型计算每个Cys对之间的距离，并且根据在阈值内的距离，预测1对Cys形成二硫键的可能性[22]。
1.2.3 脱酰胺和异构化 Asn脱酰胺和Asp异构化是单抗药物最常见的2种降解途径。脱酰胺会导致单抗活性损失，使蛋白质局部疏水性发生变化，影响单抗的空间结构，降低活性，改变生物功能，影响代谢。单抗中Asn和Gln会发生非酶催化的脱酰胺，生成Asp和Glu，其中Asn更普遍，通常发生的位点为：Asn-Gly、Asn-Ser、Asp-Gly。约 70% 的脱酰胺会产生Asp的异构化，异构化的位点主要包括Asp-Gly/Ser/Asp，在pH<6且温度较高时更易发生，脱酰胺单抗会形成酸性峰，且该反应在单抗的长期储存过程中也有可能发生，在pH >7环境中的发生速率很快，这些具体位点的鉴定可通过肽图-质谱来确认。如果CDR的Asp残基后面是Gly、His或Ser残基，通常易于异构化[23-25]。异构化可能导致抗原结合亲和力降低[25-26]。因此，在进行抗体生物信息学评估时，需要关注CDR的Asn残基以及Asn-Gly残基，并在强制降解阶段对其进行评估。
1.2.4 氧化 单抗序列中Trp或Met的氧化是单抗分子的另一个重要化学降解反应。造成单抗氧化的活性氧可能来自细胞培养基、设备中的金属离子、制剂中添加的吐温和保存运输过程中的光照等。单抗氧化除了可能会造成活性丧失，还可能引起聚集体形成，甚至产品变色[27]。但并不是序列中所有Trp和Met都会氧化，只有暴露在溶剂环境中的位点才会发生，因此对单抗氧化位点的预测需结合单抗高级结构进行模拟计算。Yang等[28]对处于临床阶段的121个抗体进行了表面Met氧化位点的预测，同时也采用过氧化氢处理这些抗体，强制其氧化，并应用质谱对氧化位点进行了逐一鉴定，结果显示模拟预测和实际实验结果有很好的相关性。
2、单抗成药性高通量实验性评估
早期受限于可获得的单抗样品量，通常采用高通量的方式进行筛选，主要包括对溶解度、构象稳定性、血清稳定性以及物理稳定性等进行分析。
2.1溶解度
单抗在溶液中会有蛋白质-蛋白质间相互作用，这种作用力主要由分子表面的疏水基团和电荷分布决定。当相互作用力表现为排斥力时，溶液就会表现出相对较好的胶体稳定性，当相互作用表现为吸引力时，就会产生聚集甚至沉淀，此即为单抗的胶体稳定性。胶体稳定性直观地反映了单抗的溶解度，溶解度是单抗生产开发的重要条件，在足够高的浓度（>100 mg/ml）下获得可溶性单抗的稳定配方仍然是一个主要挑战[29]。据估计，超过90%的潜在蛋白药物由于溶解度低而不适合开发[30]。为了提高依赖单抗溶解度的产品的成功概率，常用的策略包括避免潜在的困难目标，专注于提供更好的高溶解度的单抗，或优化单抗的制剂配方以提高溶解度。有许多方法可用于溶解度的测量，包括采用超滤膜浓缩单抗溶液，直到观察到相变（沉淀或其他固体形式），或将冻干单抗粉溶解到高浓度溶液中，以及基于静态光散射技术得到的第二维里系数和基于动态光散射技术得到的扩散相互作用指数，均可用于指示单抗分子间作用力大小。尽管有很多方法可以用来测定蛋白质的溶解度，但在新药开发过程的早期阶段，单抗的可获得性可能是一个限制因素。因此，采用高通量的方法预测单抗溶解度的能力将对候选单抗的选择和后期配方开发极为有利。
研究表明，蛋白质溶解度与溶液中聚乙二醇的质量百分比之间存在对数线性关系[31-32]。聚乙二醇诱导单抗沉淀的方法是基于液-液分离现象，如果抗体溶液会产生液-液分离，那么结晶及胶体聚集就会存在，以此来评价单抗的表观溶解度。值得注意的是，表观溶解度仅表示在含有聚乙二醇的溶液条件下，根据上清液中蛋白质的浓度推断出的蛋白质在无聚乙二醇时的溶解度。虽然表观溶解度不是单抗的实际溶解度，但在单抗早期筛选过程中，作为一种快速、高效、所需样品量少的研究方法，有助于在开展耗时和昂贵的单抗开发过程之前排除具有潜在溶解度和外观问题的单抗。
2.2构象稳定性
单抗构象稳定性研究中，不同的结构域表现出的稳定性不同，其中最不稳定的结构域决定了整个蛋白分子的稳定性。在所有的人Ig制剂中IgG1和IgG2亚型约占总量的90%[33]，这2种亚型的CH2区最不稳定，易发生去折叠，该区主要为β折叠，含有较多芳香族氨基酸残基，荧光染料与其结合可产生较强的荧光[34]。目前用于构象稳定性研究的方法有圆二色谱法（circular dichroism，CD）、差示扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC）、差示扫描荧光法（differential scanning fluorescence，DSF）等。CD是通过升温过程中，扫描单抗分子中暴露的手性基团来监测结构和构象的变化。DSC则是根据蛋白质在解折叠的过程中会吸收热量，通过记录热量的变化来测定单抗的熔融温度（melting temperature，Tm）。DSF与DSC方法过程类似，是根据单抗解折叠过程中疏水基团暴露后与荧光染料结合，通过监测荧光染料的变化而测定单抗的Tm。虽然DSC法与DSF法测定蛋白结构域去折叠温度的原理不同，但DSC法及DSF法测得的Tm值均表征人Ig CH2区的构象变化，具有较好的一致性；并且DSF方法在测定过程中样品用量少，仅需20~25 μl样品，可在2 h内同时测定30种以上单抗样品的结构稳定性。就早期成药性研究而言，建议采用DSF方法进行结构稳定性评估。有研究发现，Tm与细胞培养表达量有高度的相关性。Tm值越高，蛋白构象越稳定，往往表达量也越高[35]。近期1项对处于临床阶段的137个单抗各种理化性质的聚类统计分析也表明，瞬时表达量与Tm高度相关[36]。这可能与单抗的构象稳定性有关，稳定性好的蛋白质容易迅速折叠分泌至胞外，而不稳定的蛋白质则会在细胞内蓄积，形成细胞毒性而造成细胞活率下降。因此，Tm值也成为早期成药性评价中的常用指标。
2.3血清稳定性
在胶体稳定性和构象稳定性研究的基础上，通过进一步的血清稳定性来初步判断单抗的半衰期，同时为给药剂量的确定提供基础，是单抗开发早期药代动力学研究的一个重要方面，也是评估药物能否进行下一步开发的重要依据。血清稳定性通常分为体内血清稳定性和体外血清稳定性。体内血清稳定性检测多采用小鼠或大鼠等实验动物为研究对象，检测给药后血药浓度的变化。体外血清稳定性检测则是在体外采用健康AB血型男性的血清进行试验，观察单抗在血清中的稳定性[37]。体内血清稳定性检测往往所需样品量大、时间长，而体外血清稳定性检测通常在48 h内可以得出结果，对于早期成药性筛选而言，体外血清稳定性检测更方便、快捷。
2.4物理稳定性
与上述几种稳定性研究方法不同，物理稳定性研究所需样品量大、耗时长，不属于高通量的方法，但它能直观地反映单抗的稳定性且能用于推测单抗的长期稳定性，在筛选出初步的单抗序列后有必要进行40 °C、2周的物理稳定性研究。在40 °C条件下评估聚集、电荷异质性和修饰，方法包括分子排阻色谱、毛细管电泳、动态光散射和浊度测量等，并根据需要通过质谱法对降解产物进行详细表征。
3、总结
单抗早期成药性评估过程旨在从开发初期就鉴定出具有生物学活性、易于生产及稳定的治疗性单抗候选分子。一个新的单抗从早期序列筛选、生产工程细胞株构建，再到细胞规模化培养、纯化、制剂、检定方法开发及临床研究，需经历一个较长的研发过程和巨大的资金投入，因此为了降低后期开发的风险，前期对候选抗体分子进行各项可开发性评估至关重要。
本文提到的序列分析预测是早期序列选取过程中需要考虑的问题，由于各项预测均基于模拟的计算方法所得，因此任何一项结果指示出的单抗不理想性质，并不足以直接否定该单抗分子成功商业化的可能性。但一个单抗分子所表现出的不理想指标越多，意味着后期失败的风险越大，因此，需要对所有评价方法得到的结果进行综合评估，且在获得单抗样品后应及时采用实验的方法（如质谱）对PTM进行确认，以保证选取序列的后期可开发性。
单抗筛选过程中，在生物学活性鉴定的基础上，结合处方前研究工作，对筛选出的优选分子进行进一步评价和优化，则是单抗药物发现中更有效率、成功率也更高的一种成药性评价策略。通过高通量实验对单抗分子开发过程中的溶解度、稳定性等指标进行快速有效的评估，以发现后期培养、纯化、制剂开发过程中可能面临的问题，并在前期筛选过程中进行综合考量，最终选取活性高、稳定性好的单抗进行后期开发，可以极大地降低开发风险，与仅基于生物活性的鉴定相比，良好的开发性策略可帮助选取成药性更高的分子。
引用本文：杜洪桥, 吴小丽, 黄仕和. 基于制剂开发的单克隆抗体药物早期成药性研究策略 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(2):109-114.
DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20220823-00054
