超声检测原理是基于声波传播和反向散射行为，探查不同深度的非透明组织，并且无需调节样本，是一种可以克服光衍射限制的非破坏性技术。该技术通过定量成像方法、补偿声学效应以及利用体积成像进行生物支架的可视化分析，从而提供客观、准确且实时的生物支架开发表征数据，在研究软骨修复策略领域具有重要应用价值。
本期，EFL 以发表在杂志《Acta Biomaterialia》上的“Standardised quantitative ultrasound imaging approach for the contact-less three-dimensional analysis of neocartilage formation in hydrogel-based bioscaffolds”研究为例，介绍一种通过对从组织中返回的射频信号进行频谱分析来实现标准化的定量超声成像（SQUI）方法。作者以基于GelMA水凝胶构建不同软骨成熟水平的体外组织为例，来验证SQUI方法的应用潜力。
1. 为什么选择GelMA水凝胶构建不同软骨成熟水平的体外组织？
GelMA水凝胶具有成分清晰，透光性好的优点，常见应用于各种水凝胶成像和分析技术。同时，GelMA水凝胶具有生物相容性优，光照机械性能可调的特点，满足该研究通过改变GelMA浓度（6%，8%，10% w/v）和培养时间（0，14，28天）来构建具有不同软骨成熟水平的体外组织模型的需求，这种可控的变化对于研究软骨组织工程的动态至关重要。（EFL可提供系列GelMA产品，点击文字查看详细介绍 ）
2. 如何利用SQUI方法？
1）本文所研究的生物支架和所用超声设备的概述
图1 本研究所检测的样品及实验装置。
2）生物学表征
在进行SQUI方法评估前，作者先评估人脂肪源性间充质干细胞（hADSCs）在光交联GelMA水凝胶生物支架中经软骨分化后的透明软骨细胞外基质的表达差异化情况。评估包括对透明软骨标志物（II型胶原蛋白和胶原纤维）的定量、II型胶原基因表达和提取的糖胺聚糖（GAG）。结果表明，GelMA浓度对II型胶原蛋白生物标志物COL2A1的含量有显著影响，并与GelMA浓度成反比。
图2 调控负载脂肪间充质干细胞GelMA支架构建不同的体外新生软骨组织。
3）声速、衰减和厚度的轮廓扫描
实验结果显示，声速和衰减的轮廓，生物支架轮廓周围的声速值被低估，衰减图像中出现双环异常高衰减的伪影。这种伪影被归因于换能器近场焦点与生物支架表面的相互作用，引起声波束的折射。为了排除这些轮廓伪影，并评估支架整体的声学属性，选择了支架内部直径约2mm的感兴趣区域（ROI）。
图3 无细胞和载细胞GelMA生物支架的轮廓扫描数据分析结果。
4）生物支架的2D/3D超声成像
标准化定量超声成像（SQUI）方法可视化分析了生物支架的微观结构和总体形态，并对2D原始灰度图像与其对应的局部衰减和IBC图像进行了比较。2D-IBC图像显示了GelMA浓度的显著差异。基于IBC图像与显微镜图像的相似性，假设高强度IBC特征归因于ECM（细胞外基质）的区域。3D图像显示了全局和阈值化IBC值。然后处理了生物支架足迹上每个栅格扫描平面的标准化2D-IBC图像，并结合处理后的2D-IBC图像形成了3D-IBC图像。
图4 第28天GelMA载细胞生物支架的代表性2D-IBC图像。
图5 不同时间点的GelMA载细胞支架的侧视3D-IBC图像。
5）3D-IBC图像的体积量化
对渲染的3D图像进行了总结，使其能够进行定量评估。这些图像通过其IBC分布的体积直方图进行了分析。对于不同GelMA浓度（6%、8%、10%）的细胞生物支架，结果表明软骨生成过程中的单调增加，特别是在log IBC区间-2.8至-1.4。对于10%的生物支架，与其他生物支架相比，28天时直方图值出现衰减。
图6 基于3D-IBC图像计算获得的体积直方图。
6）Sonomarker强度作为软骨形成描述符的鉴定&基于Sonomarker强度分析细胞生物支架
评估了体积直方图以探究在软骨形成过程中是否有特定的IBC强度经历了较大的变化，确定了声学标记（sonomarker）的强度，作为软骨形成的描述标志，对描述生物支架体积属性及其在软骨形成不同时间点的变化具有重要作用。
图7 将3D-IBC图像定量为体积直方图，并识别新软骨sonomarker强度。
7）基于Sonomarker下的生物支架选择性成像
通过在特定的声学标记Sonomarker呈现的3D图像，有助于可视化生物支架的微观结构和ECM（细胞外基质）的发展。
图8 基于新生软骨sonomarker强度，可视化GelMA生物支架的微观结构。
8）Sonomarker强度与生物标志物的相关性
探讨了Sonomarker强度与生物标记之间的相关性。使用线性回归分析比较了声学标记直方图与软骨形成第28天时的主要生物标记（GAG、COL2A1和胶原纤维）之间的关系。声学标记的强度与这些生物标记显示出良好的相关性。
图9 Sonomarker强度与标准新软骨生物标志物的相关性。
9）SQUI方法在人类关节软骨样本上的应用
研究了SQUI方法在人类关节软骨样本上的应用，以验证新软骨声学标记在天然组织中的相关性。这表明了SQUI方法在非破坏性分析软骨再生方面的潜力。
图10 基于SQUI方法对人关节软骨标本的声学评价。
3. 本文的创新点
本文的创新性主要体现在以下几个方面：
（1）标准化定量超声成像（SQUI）技术的开发与应用：本研究开发了一种新的超声成像方法，即SQUI，用于非破坏性三维成像和定量分析水凝胶基生物支架中的软骨形成。这种方法克服了传统成像技术的限制，如需破坏样品或无法提供三维数据。
（2）生物支架的详细声学特性分析：该研究不仅评估了生物支架的形态变化，还通过测量声速、衰减和厚度等声学参数，对其物理和生物特性进行了全面分析。这为理解生物支架在软骨工程中的行为提供了新的视角。
（3）定量分析与生物标志物的关联：研究通过定量超声成像技术分析了生物支架中新生软骨形成的过程，并将其与传统的生物标志物（如II型胶原、GAG）相关联。这种方法的开发为评估和监测生物支架中细胞活动和组织再生提供了新的工具。
（4）3D图像的渲染与分析：通过渲染和分析3D-IBC图像，本文展示了生物支架在软骨生成过程中的形态变化。这种三维视角对于理解和优化生物支架的设计至关重要。
（5）声学标记的识别和应用：研究中识别了特定的声学标记强度，并将其用于分析生物支架的特性。这种方法的创新在于使用声学参数作为评估和描述生物支架中软骨形成的新指标。
4. 总结
该研究展示了超声波的非破坏性体积和定量成像技术，在检测以GelMA为基质的3D生物支架中新生软骨形成的潜力。通过标准化定量超声成像（SQUI）方法与批量轮廓扫描的结合，以及3D图像渲染技术，可实现生物支架相关软骨新生形态和理化性能改变的监测。
文献来源：https://doi.org/10.1016/j.actbio.2022.05.037
