分子荧光光度法在药物分析中具有很高的应用价值。它能够实现对微量物质的检测和定量分析，具有很高的选择性和灵敏度，在药物分析中应用广泛。
一、分子荧光产生的机理
1.1 分子的激发态
当分子吸收辐射能量后，价电子从基态跃迁到一个更高的能级，分子的这种状态称为激发态。
由于电子跃迁过程中可能发生自旋方向的变化，以M表示电子激发态的多重度。
M=2s+1
其中s为电子自旋量子态。
根据Puali不相容原理，分子轨道中成对的电子都是自旋方向相反的，两个电子自旋量子数m分别为+1/2和-1/2，如果激发后两个电子自旋方向不变，此时电子激发态多重度为：
M=2*[(+1/2)+(-1/2)]+1=1
称这种状态为激发单重态，用S表示。
如果分子轨道中电子对被激发后产生了自旋方向的改变，此时两个电子的自旋量子数分别为+1/2和+1/2，此时电子激发态多重度为;
M=2*[(+1/2)+(+1/2)]+1=3
称这种状态为激发三重态，用T表示。
1.2激发态分子的衰变方式
激发态的分子不稳定，较短时间内，电子就会跃迁至基态，释放出与吸收时相同数量的能量。电子跃迁时，如果以释放光子的形式放出能量，称为辐射跃迁；如果以振动或热能方式放出能量，称为非辐射跃迁。
辐射跃迁过程分子产生荧光和磷光；非辐射跃迁包括振动弛豫(VR)，内转化(ic)，系间窜越(isc)。
振动弛豫(VR)是指分子在受到外界激发后，振动能量逐渐转化为其他形式的能量，最终使分子回到当前电子能级最低振动能级的过程。分子的振动能量会逐渐转化为分子的转动能量，也可能通过分子与周围环境的相互作用而转化为热能。
内转化(ic)是指分子在激发态下，通过非辐射的方式将能量转化为分子内部振动、转动或电子结构的改变的过程。在这种过程中，分子从相同多重态的一个电子能级衰变到另外一个电子能级，但并不通过辐射光子释放能量。
系间窜越(isc)是指分子在激发态下，通过非辐射的方式将能量从一个电子多重态到另一个电子多重态的过程。同样的，不通过辐射光子释放能量
1.3荧光和磷光的产生
图1为Jablonski能级图，假如分子被激发到S2电子激发单重态，在较短时间内，会通过振动弛豫回到该电子能级的最低振动能级，然后通过内转化的形式，最终回到第一激发单重态，然后通过振动弛豫衰变到第一激发单重态的最低振动能级。
此时如果电子跃迁到基态，并以辐射形式放出能量，称为荧光(F)。
此时如果电子通过系间窜越跃迁到三重态，经振动弛豫，衰变到该能级最低振动能级后，以辐射形式放出能量，称为磷光(P)。
由于激发单重态间内转化速率很快，并且S2及以上的激发态寿命很短，很快衰变至第一激发单重态的最低振动能级，所以观察到的荧光通常是电子由第一激发单重态最低振动能级跃迁至基态而产生的，且持续时间短。
由于系间窜越是自旋禁阻的，因此其速率较慢。同时由于第一激发三重态能量低于第一激发单重态，分子较为稳定，所以分子磷光常常能持续一段时间。
图1 Jablonski能级图
二、分子荧光光度法在药物分析中的应用
分子荧光光度法在药物分析中有下列应用：
(1)生物样品中的药物含量定量分析。例如通过分子荧光光度法可以直接从血液、尿液等生物样品中定量测定某些抗生素、抗病毒药等药物的含量。
(2)复方制剂中的单一成分含量定量。例如可以从复方胶囊、片剂等复方制剂中，选择性地定量某一有效成分。
(3)原料药和制剂中的质量控制。例如可以用于原料药和成品药中的有效成分含量检验，以确保质量符合标准。
(4)药物浓度动态监测。例如可以实时监测体外试验中的药物浓度变化曲线，为药代动力学研究提供参考。
分子荧光光度法适用于测定含有共轭体系的脂肪族有机化合物，如维生素A等；以及含有共轭体系的芳香族有机化合物及衍生物，如苯并(a)芘，黄曲霉毒素G等。
三、影响分子荧光的因素
3.1 溶液中杂质的影响
在溶液中，杂质会对分子荧光产生影响。这种影响通常被称为颗粒对分子荧光的猝灭作用，主要有两种类型：
静态猝灭：颗粒（如固体颗粒或大分子）的存在会导致分子荧光的静态猝灭，这是因为颗粒的吸收和散射作用会减少分子激发态的寿命，从而降低分子发生荧光的可能性。颗粒越多，静态猝灭效应就越显著。
动态猝灭：颗粒的运动也可能对分子的荧光产生影响。颗粒的运动会导致分子的激发态能量被传递给颗粒，从而减少分子荧光的发射。这种效应通常在颗粒与分子之间存在较大的运动相互作用时发生。
在实际应用中，颗粒对分子荧光的影响可能会对定性和定量分析产生干扰。因此，在进行实验时，需要考虑溶液中颗粒的存在，并采取相应的措施来减少或纠正这种影响，例如采用高纯度溶剂，对溶剂进行过滤，对溶液进行离心等。
3.2 pH对分子荧光的影响
许多分子荧光发射强度会随着溶液pH的变化而改变。这是因为pH的变化会影响分子的电荷状态，从而影响电子由激发态到基态之间的跃迁，进而影响荧光发射的强度。
溶液的pH也可能会影响分子荧光的发射波长。一些蛋白质在不同pH条件下会表现出不同的发射波长。
部分化合物的荧光在不同pH条件下的稳定性也不同，有些在酸性条件下会发生猝灭，而在碱性条件下荧光则更加稳定。
3.3氧分子的影响
氧分子的猝灭作用：氧分子可以与分子的激发态发生碰撞，从而使其由激发态衰变至基态，这种现象被称为氧分子的猝灭作用。氧分子的猝灭作用会导致分子荧光的强度降低，从而影响荧光测量的准确性。因此，在进行荧光实验时，需要避免或减少氧分子的存在，例如在实验过程中使用氮气或氩气气氛。
氧分子的光敏作用：氧分子的存在可能会导致光敏反应的发生，从而影响分子的荧光性质。例如，氧分子可以与一些荧光染料发生光氧化反应，导致其荧光发射强度的降低或发射波长的变化。
3.4温度的影响
温度可以对分子荧光产生影响，主要有以下几个方面：
分子的激发态寿命：温度的升高会增加分子的振动和旋转，从而缩短分子的激发态寿命。这会导致荧光发射强度的降低或发射波长的变化。
分子的荧光发射强度：温度的升高会增加分子的热运动，从而增加分子与周围分子的碰撞，导致荧光发射强度的降低。
分子荧光的稳定性：一些物质分子会在高温下可能会发生猝灭，导致荧光发射强度的降低。
因此，在进行荧光实验时，需要控制温度的变化，进行必要的校正和控制。例如，可以使用恒温器或冷却器来控制温度。
3.5表面活性剂致荧光猝灭
对于很多化合物，要避免表面活性剂的使用，特别是与目标物质带有相反电荷的表面活性剂。盐酸肼屈嗪是一种治疗高血压的药物，化学结构式如图2所示，带正电，因其具有共轭体系，故具有荧光性质，但当其与阴离子表面活性剂，如脂肪酸盐混合时会产生荧光猝灭效应。
图2 盐酸肼屈嗪
另外在进行分子荧光测定的过程中，应注意有些物质弛豫时间较长，此时可采用具有近似激发和发射波长的物质作为参比溶液，使得定量更为准确。
目前为止，荧光光度法在药学中应用较为广泛，将荧光光度法与液相色谱联用，可以用于物质的定性定量分析。
参考文献
中华人民共和国药典(2020版)
中国药典分析检测技术指南
分析化学(第五版) 武汉大学主编
