液相色谱法为测试原料药、中间体、制剂和包材中各成分含量及杂质的主要方法，但许多物质并没有标准方法可依据，此时免不了需要开发新的方法。而液相方法开发中，色谱柱作为液相色谱法的核心，如何选择合适的色谱柱就显得至关重要。本文笔者将从总体思路、考虑因素和应用范围三方面阐述如何选择液相色谱柱。
一、 液相色谱柱选择的总体思路
1.评估待测物的理化性质：如化学结构、溶解性、稳定性（如是否易被氧化/被还原/水解）、酸碱性等，尤其化学结构是决定性质的关键因素，如共轭基团有强紫外吸收和强荧光性；
2.确定分析目的：是否要求高分离度、高柱效、短分析时间、高灵敏度、耐高压、长柱寿命，低成本等；
3.选择合适的色谱柱：了解色谱填料的成分、物理和化学性质，如填料的粒径、孔径、耐受温度、耐受pH、对待测物质的吸附性等。
二、 液相色谱柱选择的考虑因素
本章节内容将从色谱柱本身的理化性质论述色谱柱选择时需考虑的因素。
2.1 填料基质
2.1.1 硅胶基质
大多数应用的液相色谱柱填料基质为硅胶，此类填料纯度高、成本低、机械强度大，易于修饰基团（如苯基键合、氨基键合、氰基键合等），但耐受的pH值和温度范围有限：大多硅胶基质填料的pH适用范围为 2～8，但经过特殊修饰的硅胶键合相pH适用范围可宽至1.5～10，还有经过特殊修饰的硅胶键合相在低pH下稳定，如安捷伦ZORBAX RRHD stablebond-C18的pH在1～8稳定；硅胶基质的耐受温度上限通常是60 ℃，有的色谱柱在高pH下的耐受温度为40 ℃。
2.1.2 聚合物基质
聚合物填料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂，其优点是耐受的pH值范围宽——在1～14均可使用，另外更耐高温（可以达到80 ℃以上）。相对于硅胶基质的C18填料，这类填料具有较强的疏水性，而且大孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效。其缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低，机械强度小。
2.2 颗粒外形
大多现代HPLC填料都是球形颗粒，但有时是不规则的颗粒。球形颗粒可提供较低的柱压、较高的柱效、稳定性以及较长的寿命；在使用高粘度的流动相（如磷酸）或样品溶液较粘稠时，不规则颗粒有较大的比表面积，更有利于两相的充分作用，且价格相对低廉。
2.3 颗粒粒径
粒径越小，柱效越高、分离度越高，但耐高压性越差。最常用的是5 μm粒径的色谱柱；若对分离度要求较高，可选择1.5～3 μm的填料，有利于解决一些基质复杂、多组分样品的分离问题，UPLC可以使用1.5 μm的填料；10 μm或更大粒径的填料常用于半制备或制备柱。
2.4 含碳量
含碳量指的是硅胶表面键合相的比例，与比表面积和键合相覆盖率等有关。高含碳量提供高柱容量、高分辨率，常用于要求高分离度的复杂样品，但由于两相相互作用时间较长，导致分析时间较长；低含碳量的色谱柱分析时间较短、可展现不同的选择性，常用于需要快速分析的简单样品及需要高水相条件的样品。一般C18的含碳量在7 %-19 %不等。
2.5 孔径和比表面积
HPLC吸附介质是多孔的颗粒，大多数的相互作用于孔内进行。因此，分子必须进入孔内才能被吸附和分离。
孔径和比表面积是相辅相成的两个概念。孔径小、比表面积大，反之亦然。比表面积大，可增加样品分子与键合相之间的作用、增强保留、提高载样量和柱容量及复杂成分的分离度，全多孔型填料就属于此类填料，对分离度要求高的建议选择比表面积大的填料；比表面积小，可降低背压、提高柱效和减少平衡时间，适合梯度分析，核壳型填料就属于此类填料，在保证分离度的前提下，对分析效率要求高的建议选择比表面积小的填料。
2.6 孔容和机械强度
孔容，又称“孔体积”，指单位颗粒的空隙体积大小。它能很好的反映填料的机械强度。孔体积大的填料相对孔体积小的填料机械强度要略弱。孔体积小于等于1.5 mL/g的填料大多用于HPLC分离，而孔体积大于1.5 mL/g的填料主要用于分子排阻色谱和低压色谱。
2.7 封端率
封端能够降低化合物与裸露的硅醇基相互作用（如碱性化合物与硅醇基的离子结合，酸性化合物与硅醇基的范德华力、氢键作用）而产生的拖尾峰，从而提高柱效和改善峰形。不封端键合相，相对封端键合相会产生不同的选择性，尤其对于极性样品。
三、 不同液相色谱柱的应用范围
本章节将通过一些案例讲述不同类型液相色谱柱的应用范围。
3.1 反相C18色谱柱
C18色谱柱为最常用的反相色谱柱，能满足大多数有机物的含量及杂质测试，对中等极性、弱极性和非极性物质均适用。而选择何种类型和规格的C18色谱柱应结合具体的分离需求而定，如对分离度要求较高的常选用5 μm*4. 6mm*250 mm规格；分离基质复杂和极性接近的物质，可选用4 μm*4.6 mm*250 mm规格或粒径更小的规格，如笔者在检测塞来昔布原料药的两种基因毒性杂质时采用的就是3 μm*4.6 mm*250 mm规格的色谱柱，两种物质的分离度可达到2.9，分离度上佳。另外，在保证分离度前提下，若需实现快速分析，往往选择10 mm或15 mm的短柱，如笔者在用LC-MS/MS法检测磷酸哌喹原料药中的一种基因毒性杂质时采用的是3 μm*2.1 mm*100 mm的色谱柱，杂质与主成分的分离度为2.0，且5 min即可完成一个样品的检测。
3.2 反相苯基色谱柱
苯基色谱柱也属于反相色谱柱中的一种，此类色谱柱对芳香族化合物有较强的选择性，若普通C18色谱柱测得的芳香族化合物响应较弱可考虑更换苯基色谱柱，如笔者在做塞来昔布原料药时，用同一厂家、同规格（均为5 μm*4.6 mm*250 mm）的苯基柱测得的主成分响应约为C18柱的7倍。
3.3 正相色谱柱
正相色谱柱作为反相色谱柱的有效补充，适用于大极性化合物，如反相色谱柱中用超过90 %水相洗脱时出峰仍很快，甚至与溶剂峰接近和重合，此时可考虑更换正相色谱柱。此类色谱柱包括hilic柱、氨基柱、氰基柱等。
3.3.1 hilic柱
hilic柱通常在键合烷基链中嵌入亲水基团以增强对极性物质的响应，此类色谱柱适用于糖类物质的分析，笔者在做木糖及其衍生物的含量和有关物质时采用的就是此类色谱柱，对一种木糖衍生物的异构体也能实现良好分离；
3.3.2 氨基柱和氰基柱
氨基柱和氰基柱是指在键合烷基链末端分别引入氨基和氰基修饰，以提高对特殊物质的选择性：如氨基柱在糖类、氨基酸、碱、酰胺类物质的分离方面是一个很好的选择；氰基柱由于存在共轭键，故在分离氢化和未氢化结构相似物时的选择性较好。氨基柱和氰基柱往往可以在正相色谱柱和反相色谱柱之间切换使用，但不建议频繁切换。
3.4 手性色谱柱
手性色谱柱，顾名思义，适用于手性化合物的分离和分析，尤其在药物领域的异构体中应用广泛。当常规的反相和正相色谱柱无法实现异构体的分离时可考虑采用此类色谱柱。比如，笔者在做1,2-二苯基乙二胺的两种异构体：(1S, 2S)-1, 2-二苯基乙二胺和(1R, 2R)-1, 2-二苯基乙二胺时采用的是5 μm*4.6 mm*250 mm的手性色谱柱，两者的分离度达到2.0左右。但是手性色谱柱较其他类型色谱柱价格要高，通常在1W+/根，若有此类色谱柱需求的单位还需要做好充足的预算。
3.5 离子交换柱
离子交换柱适用于带电离子的分离和分析，如离子、蛋白质、核酸、部分糖类物质等。按照填料类型分为阳离子交换色谱柱、阴离子交换色谱柱、强阳离子交换色谱柱。
阳离子交换色谱柱包括钙基、氢基柱，主要适用于氨基酸等阳离子物质的分析，如笔者在做一种冲洗液中的葡萄糖酸钙和醋酸钙的分析时采用的是钙基柱，两种物质在λ=210nm均有较强的响应，分离度达到3.0；笔者在做葡萄糖有关物质时采用的是氢基柱，几种主要的有关物质——麦芽糖、麦芽三糖和果糖在示差检测器下均有较高的灵敏度，检测限最低可达到0.5 ppm，分离度可达到2.0-2.5。
阴离子交换色谱柱主要适用于有机酸、卤素离子等阴离子物质的分析；强阳离子交换色谱柱具有更高的离子交换容量和选择性，适用于复杂样品的分离和分析。
以上仅是结合笔者自身经验介绍了几种常见液相色谱柱的类型和应用范围，实际应用中还有其他特殊类型的色谱柱，如大孔径色谱柱、小孔径色谱柱、亲和色谱柱、多模式色谱柱、超高效液相色谱柱（UHPLC）、超临界流体色谱柱（SFC）等，它们在不同领域中发挥着重要的作用，具体选择何种类型的色谱柱，需要根据样品的结构和性质、分离要求和其他目的来进行选择。
四、 结论
本文笔者结合液相色谱柱本身的性质特点和自身使用经验，总结出一套液相色谱柱的选择方法，希望为广大同行助力，更希望抛砖引玉，让优秀的老师们分享更多关于液相色谱柱选择方面的干货，大家共同进步！
