近年来，小核酸药物成为生物制药企业的研发热点，小核酸药物专指靶向作用于RNA或蛋白质的一类寡核苷酸分子，包括反义寡核苷酸（ASO）、siRNA、aptamer等；目前，我国小核酸药物主要是按照化学药注册申报，接下来，我们对小核酸药物相关法规进行梳理；目前我国并没有针对寡核苷酸药物的法规及指导原则，只能参考国外相关的指导原则以及化学药物开发的相关指导原则。
药学研究可参考资料
原料制备工艺方面
2018年01月15日食品药品监管总局关于发布新药I期临床试验申请技术指南的通告（2018年第16号）[1]，在该指南中针对原料药提出，“对于采用发酵工艺、提取工艺制备以及多肽、小分子核酸药物等，需要提供更多的制备工艺信息”，也就是说，对于小核酸药物的原料工艺需要提供较多的制备工艺，我们知道，小核酸药物的序列合成步骤包括脱DMT、偶联、氧化、加帽四个步骤，根据不同的序列，合成步骤需要一定的循环才能够得到我们所需序列长度，在这个过程中，不同的工艺参数以及试剂质量均会对最终成品有一定影响，因此需要提供更多的制备工艺。
2022年5月31日国家药监局药审中心关于发布《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》的通告（2022年第31号）[2]，虽然该指导原则中指出，该指导原则可能不完全适用于通过化学合成工艺生产的核酸类产品，如反义寡核苷酸类产品及其衍生物，但部分内容还是可以参考；比如：指导原则中提出对于核酸药物需要根据工艺特点，化学合成的核酸组分（如sgRNA）的药学研究在参考本指导原则的同时，还需参考化学合成产品相关的技术要求；
对于目的基因选择和设计我们需要考虑疾病的发病机制、产品的作用机制、人种间的序列差异，以及基因表达产物的免疫原性、功能活性和安全性等；对于靶向结合作用的核酸序列如sgRNA、siRNA等，需评估设计的合理性，并在开发过程中对序列的靶向特异性和上靶/脱靶风险进行评估和确认。对于mRNA 类蛋白质编码序列，应考虑5’-帽或类似物结构的类型和设计、poly A 尾的序列和长度及长度分布、翻译调控元件、核苷修饰类型、序列自我复制能力、递送系统等对产品的免疫原性、表达活性和载体稳定性的影响。
对于需要递送系统的药物，递送材料/介质的选择需要有合理的依据，对材料/介质本身一般应考虑材料/介质的生产工艺、质量控制、人体安全性、材料/介质的稳定性等，对递送材料/介质与核酸组成的递送系统，还需考虑系统的核酸保护作用、递送效率、胞内核酸释放功能、递送系统的稳定性，以及递送系统的工艺稳定性和质量变化等。
2021年FDA发布关于寡核苷酸药物的CMC指南草案[3]中提出，对于原料药的制备方法需要提供流程图，包括序列合成（脱保护、偶联、氧化、加帽），纯化，以及冻干等步骤完整的描述，关键步骤的描述，申请者应提供用于生产药物的物料清单(如起始物料、试剂、溶剂、辅助材料等)。对于原料的理化性质需要研究药物的吸湿性，水中的溶解性以及熔化温度（Tm）等。
除此之外，还可以参考ISO 20688-1-2020[4]合成寡核苷酸的生产和质量控制要求，进行开发。
质量控制方面
质量控制方面，大部分可参考ICH Q系列[5]，包括稳定性可参考ICH Q1、方法验证可参考ICH Q2、杂质（残留溶剂、元素）ICH Q3C和Q3D、2020版《中国药典》、原料药GMP指南ICH Q7、致突变杂质可参考ICH M7；对于有机杂质ICHQ3A和Q3B可能不太适用，特别是与寡核苷酸药物相关的杂质，比如N-1,N-X，N+X等相关杂质，因为寡核苷酸药物与小分子药物有一定的区别，通常情况下寡核苷酸药物分子量明显大于小分子药物（下图是寡核苷酸药物与小分子药物的区别），寡核苷酸药物的分子量通常大于小分子药物，小于抗体药物，寡核苷酸药物的分子量通常在7000~14000Da，而小分子药物通常小于500Da，这也就意味着若杂质控制完全按照小分子药物杂质去控的话，可能过于严格；而针对该类药物的杂质限度并没有相应的法规，目前可参考的主要是一些文献，比如OSWG对寡核苷酸药物的杂质进行讨论，并发表了一篇关于寡核苷酸药物杂质的文献[6]，在这篇文献中，OSWG给出了关于寡核苷酸药物的杂质决策树，OSWG推荐鉴定限为1.0%，界定限为1.5%，给出的理由是寡核苷酸药物的分子量为5000Da，而小分子药物的分子量为500Da，两者相差10倍，即1.0%的杂质数量与小分子药物0.1%相当；而多肽类药物的鉴定限为0.5%，界定限为1.0%，目前行业内更多是参照多肽类药物的杂质限度进行界定。
针对杂质，日本药品和医疗器械管理局( PMDA) 于2020年3月发布了《寡核苷酸治疗产品非临床安全性评价指导原则》[7]中提到，由于物理化学性质相似，寡核苷酸相关物质常常难以分离，难以参考 ICH Q3A 来界定。因此，寡核苷酸相关物质的安全性评价基于受试物整体的安全性试验数据。而小分子杂质、残留溶剂和元素杂质的评价参考ICH Q3、M7指导原则。
制剂研究
对于小核酸药物，如果没有递送系统，则可以参考化学药物注射剂相关指导原则进行研究，比如《化学药物制剂研究基本技术指导原则》《化学药品注射剂与药用玻璃包装容器相容性研究技术指导原则（试行）》《化学药品注射剂包装系统密封性研究技术指南（试行）》《化学药品注射剂生产所用的塑料组件系统相容性研究技术指南（试行）》等相关指导原则进行研究；如果采用了LNP递送系统，则需要对《脂质体药物质量控制研究技术指导原则》《脂质体药物非临床药代动力学研究技术指导原则》以及FDA在关于脂质体药物产品的指南中提供了特定制剂寡核苷酸药等相关指导原则进行研究。
非临床安全性研究
针对非临床安全性研究，目前我国并没有明确的指导原则，日本药品和医疗器械管理局( PMDA) 于2020年3月发布了《寡核苷酸治疗产品非临床安全性评价指导原则》，较为系统地阐述了PMDA在寡核苷酸非临床安全性评价方面的一般考虑，并提供了寡核苷酸类产品非临床安全性评价的基本框架，对于各项安全性研究试验需要重点考虑的方面也提供了建议，PMDA建议如果可从剂量递增试验、短期剂量范围探索试验、药理学试验或重复给药毒性试验中获得急性毒性信息，可不开展单独的单次给药毒性试验，对于重复毒性试验PMDA建议重点关注寡核苷酸药物在组织器官中的蓄积情况，并且对毒性反应进行评估；具体试验可以参照ICH M3（R2）；对于遗传毒性，PMDA建议，由天然核酸组成的核酸药物不必开展遗传毒性试验；对于化学修饰的核酸药物的评价，应参考 ICH S2 ( R1) 《人用药物遗传毒性试验和结果分析指导原则》。对于生殖毒性，PMDA建议，寡核苷酸的生殖和发育毒性( developmental and reproductive toxicology，DART)试验在考虑临床应用和目标疾病后，原则上参考ICH S5(R3) 《人用药物生殖与发育毒性检测》，对于致癌毒性，可参考ICH S1A《药物致癌性试验必要性指导原则》，ICH S1B《药物致癌性试验》和ICH S1C(R2) 《药物致癌性试验的剂量选择》，对于局部耐受性，PMDA建议如果可以在重复给药毒性等试验中评估给药部位，则可不进行独立的局部刺激性试验，对于免疫毒性，如果可以根据重复给药毒性等试验结果中评估，可不单独进行，如果需要做该部分试验，则可以参考 ICH S8《人用药物免疫毒性研究》；对于光毒性，如果存在特殊的光安全性问题，参考 ICH S10《药物光安全性评价》；除以上可参考的指导原则，我们还可以参考2021年FDA发布的非临床安全性评估指南草案[8]，以及寡核苷酸工作组（OSWG）发表的一些关于寡核苷酸药物的安全性评价相关[9]文献。
总体来说，寡核苷酸药物非临床安全性研究大体可参照ICH S系列[14]相关指导原则，也可以参考FDA发布的一些指南草案以及寡核苷酸安全工作组（OSWG）发布的一些文献。
非临床药代动力学研究
与安全性评价相比，药物非临床PK/ADME研究的监管指南非常有限，对于非临床药代动力学研究，OSWG推荐[10]的方法与小分子药物类似，在时间和范围上有一些差异是合理的，非临床研究设计的起点建议与监管机构讨论；对于试验时间，可以参考ICH M3（R2）提供了与临床开发相关的非临床安全性研究时间的一般概述。对于毒性动力学（TK），可以参考ICH S3A提供了关于毒性动力学（TK）的预期信息；另一方面，申办方或监管机构很少参考ICH S3B（药代动力学：重复给药组织分布研究指导原则）。美国食品药品监督管理局（FDA）代谢产物安全性评价（MIST）指南[11]提供代谢物安全性测试的相关建议。欧洲药品管理局（EMA）和FDA最近提出了关于PK药物-药物相互作用（DDI）试验的考虑点[12]。FDA发布了最新的指南草案，提出了关于寡核苷酸药物的特殊考虑。此外，FDA在关于脂质体药物产品的指南中提供了特定制剂寡核苷酸药[13]物开发的建议；ICH S9中还包含一些关于偶联和脂质体产品的有效信息，这些信息的适用性可能比抗癌药物的适用性更广泛。
综上所述，目前小核酸药物暂无针对性法规，大部分都是参考化学药相关指导原则，除了PMDA发布了《寡核苷酸治疗产品非临床安全性评价指导原则》，FDA也发布了关于寡核苷酸相关指南草案，并非正式版本，除此之外，寡核苷酸安全工作组（OSWG）也发表部分相关文献，均可参考。
以上是基于当前认知水平进行分析总结，如有错误，欢迎大家留言指正。
参考文献：
[1]NMPA食品药品监管总局关于发布新药I期临床试验申请技术指南的通告（2018年第16号）
[2]《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》的通告（2022年第31号）
[3]2021年FDA发布IND Submissions for Individualized Antisense Oligonucleotide Drug Products for Severely Debilitating or Life-Threatening Diseases: Chemistry,Manufacturing, and Controls Recommendations Guidance for Sponsor-Investigators
[4]ISO 20688-1-2020 Biotechnology — Nucleic acid synthesis — Part 1: Requirements for the production and quality control of synthesized oligonucleotides
[5] ICH Q系列指导原则
[6]Capaldi, Daniel; Teasdale, Andy; Henry, Scott; Akhtar, Nadim; den Besten, Cathaline; Gao-Sheridan, Samantha; Kretschmer, Matthias; Sharpe, Neal; Andrews, Ben; Burm, Brigitte; Foy, Jeffrey (2017). Impurities in Oligonucleotide Drug Substances and Drug Products. Nucleic Acid Therapeutics, (), nat.2017.0691–. doi:10.1089/nat.2017.0691
[7]日本药品和医疗器械管理局( PMDA) 于2020年3月发布了《寡核苷酸治疗产品非临床安全性评价指导原则》
[8]FDA发布Nonclinical Testing of Individualized Antisense Oligonucleotide Drug Products for Severely Debilitating or Life-Threatening Diseases
[9]Aure´ lie Goyenvalle等人，Considerations in the Preclinical Assessment of the Safety of Antisense Oligonucleotides；NUCLEIC ACID THERAPEUTICS Volume 33, Number 1, 2023 Mary Ann Liebert, Inc. DOI: 10.1089/nat.2022.0061
[10]OSWG Recommended Approaches to the Nonclinical Pharmacokinetic (ADME) Characterization of Therapeutic Oligonucleotides
[11]. US Food and Drug Administration (FDA). (2020). Safety testing of drug metabolites, guidance for industry. FDA. https://www.fda.gov/media/72279/download
[12]European Medicines Agency (EMA). (2012). Guideline on the investigation of drug interactions. https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline[1]investigation-drug-interactions-revision-1_en.pdf
[13]US Food and Drug Administration (FDA). (2018). Gui[1]dance for industry, liposome drug products: Chemistry, manufacturing, and controls; Human pharmacokinetics and bioavailability; and labeling documentation. https://www .fda.gov/media/70837/download
[14]ICH S系列指导原则
