1. 背景
抗体类药物是一种由抗体物质组成的药物，是属于生物药的一个大的类别。抗体类药物生产工艺及过程有别于传统化学药品，含有一些传统工艺中没有的杂质，一般归为两类，即产品相关杂质和工艺相关杂质，其中产品相关杂质有抗体的氧化和脱酰胺形式、高分子量聚集体和低分子量降解片段等，工艺相关杂质有HCP、HCD、protein A残留等，这些杂质会影响最终药品的安全性和有效性，需通过多个维度对其分子进行表征分析（如图1）才能确保其有效性、安全性和一致性[2,3]。
图1 主要表征分析技术
因此，本文就抗体类药物相关杂质及相应分析方法作一探讨，以期为该类药物相关检定提供参考。
2. 抗体类药物质量标准的相关规定
目前，抗体类药物质量标准相关规定主要参照《中国药典》三部（2020版）、《中国药典》四部（2020版）通则、WHO相关定义与要求、人用药物注册技术要求国际协调会议（ICH）对生物技术产品、生物制品及生物类似药的相关规定、FDA和《美国药典》的相关技术指南、欧洲药品管理局（EMA）相关技术规范制定。
3.抗体类药物的检定
3.1 物理检查
抗体类药物是经细胞表达、纯化和制剂工艺后获得的。不同的制剂工艺、配方、存储及运输条件均会影响其分子间及分子内部共价键和非共价键的形成或打开，从而改变抗体类药物的性状与理化性质，并最终影响抗体药物中蛋白低聚物(Oligomers，一般指30个以下单体分子聚合)、聚体(Aggregates)或片段(Fragments)的产生。
随着分散系物理化学状态的变化，当形成聚体的分子增加时，导致聚体直径越来越大，逐渐形成亚可见颗粒甚至可见颗粒；当抗体分子断裂成片段或其糖链发生降解。可能导致溶液颜色变深。如图2所示：片段为1-10nm，单体(Monomers)为5-15nm，低聚物为10-100nm，亚可见颗粒或不溶性微粒为10-100μm，可见颗粒或可见异物为大于等于50μm。
因此，对于物理检查而言，如澄清度(浊度)、不溶性微粒、可见颗粒、颜色、溶解时间等检定项目，是在可见或亚可见范围内．对抗体药物的安全性进行评价[4]。
图2 粒径分布图
3.2 杂质相关分析技术
3.2.1 基于毛细管电泳技术（CE）的纯度和杂质分析
《中国药典》四部（2020版）通则0542表明，CE是一类以弹性石英毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，根据分子电荷和分子质量大小不同实现分离的新型分离技术，是电泳与色谱结合的产物。在CE的多种分离模式中，依靠等电点分离的毛细管等电聚焦成像电泳、依靠电荷/质量比分离的毛细管区带电泳（CZE）和依靠相对分子质量大小分离的毛细管凝胶电泳（CGE）是抗体类药纯度和杂质分析中最常用的3种模式。
抗体类药物分子的修饰，如糖基的唾液酸化、谷氨酸环化、二硫键的氧化等均会影响抗体的电荷异质性及等电点。iCIEF中电解质溶液形成pH梯度，各组分迁移至各自等电点时变为中性形成条带，给出蛋白质电荷异质性分布的信息。CZE中各组分根据各自的电泳流和电渗流按阳离子（酸性峰）、中性粒子（主峰）和阴离子（碱性峰）的顺序通过检测器。目前，应用于抗体类药物还原和非还原性纯度分析（大小异质性）和N寡糖分析的CGE，由于样品蛋白质与十二烷基硫酸钠（SDS）结合形成复合物，这种模式也被称为SDS无胶筛分毛细管电泳（CE-SDS）。与SDS-PAGE比较，CE-SDS更快捷，耐用性更好，精密度及分辨率更高，且无拖尾峰、样品残留少、线性和重复性较高。由于CE-SDS检测无需对结果进行二次处理，其结果较SDS-PAGE 更准确、稳定、客观，且CE-SDS法能将非糖基化重链与重链分离后对非糖基化重链进行定量分析。
3.2.2 基于高效液相色谱技术（HPLC）的纯度和杂质分析
作为药品检测的常用技术，在众多类型HPLC中，反相色谱（RP-HPLC）、分子排阻色谱（SEC-HPLC）和离子交换色谱（IEC-HPLC）已成为抗体类药物不同方面质量检定的常用技术手段。
RP-HPLC 主要用于抗体类药物的肽图检查，《中国药典》四部（2020版）通则3405表明，通过胰蛋白酶裂解抗体类药物，形成肽段，采用RP-HPLC分析鉴定其一级结构的完整性和准确性。肽图是蛋白质及其酶解产物的指纹图谱，是抗体类药物质量控制和放行的必行检测。该项检测可监控单个氨基酸的突变、氧化、去酰胺化，也能检测抗体类药物N-末端环化、C-末端赖氨酸处理、N-糖基化等一系列非预期的表达变异。
SEC-HPLC可通过分子筛原理将蛋白质按多聚体、二聚体、单体及某些情况下出现的片段等小分子顺序分离，依次通过检测器。因此SEC-HPLC广泛应用于抗体类药物聚合物的检测，是目前常用的质控及放行检测方法。SEC-HPLC 可定量，二聚体和聚集体的分离度较高，分析时间较短，且操作简单，可收集流分进行进一步分析。
IEC-HPLC是考察抗体类药物电荷异质性的另一种手段，与CE比较操作更简单，且能检测蛋白分子表面电荷分布差异的优势。弱阳离子交换色谱柱常用于测定抗体类药物存在的酸性电荷异构体（先于主峰出峰）与碱性电荷异构体（晚于主峰出峰）。这些电荷异构体多为主峰蛋白糖基化和去酰胺化的产物，但其有限的分辨率无法将各杂质精确分离，该缺点也限制了其在抗体类药物质量控制领域更深入地应用。
随着质谱技术的发展，液相色谱与质谱联用技术在抗体类药物质量控制领域发挥着越来越重要的作用。四极杆-飞行时间（Q-TOF）高分辨质谱、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）及结合了高选择性四极杆离子过滤与Orbitrap高分辨准确质量数技术的QE高分辨质谱，在完整蛋白、肽图分析、寡糖分析、蛋白定量、蛋白测序等抗体类药物质量控制领域具有明显优势（图3）。
图3 Top-down MS
另外，亲水作用液相色谱（HILIC-HPLC）配以荧光检测器（FLD）或电喷雾检测器（CAD）[5]也在抗体类药物相关质量控制方面发挥着重要作用，如寡糖链分析与工艺中引入的表面活性剂与药用辅料检测等。随着多维液相色谱技术的发展，二维液相色谱（2D-HPLC）可将样品中难分离、需富集的杂质分离或富集用于与质谱、红外和核磁共振等的联用分析中，在抗体类药物杂质分离与鉴定等分析中发挥着越来越重要的作用。
3.2.3 工艺相关杂质分析
抗体类药物除了进行常规的无菌试验、异常毒性、热源试验、内毒素等安全性检查外，其生产过程中HCP、DNA及纯化过程使用的亲和色谱蛋白A（Protein A）等工艺杂质残留量也需进行严格控制。这些由生产过程引入的残留杂质不仅影响产品的效价，还可能在不同程度上引起机体的免疫应答，最终引起过敏反应或毒性、免疫原性、致癌性等严重的安全性问题。美国FDA规定，用一种灵敏度较高的方法检测药品的HCP，其含量应低于检测限（通常< 100 ppm）；《中国药典》三部（2020版）规定，CHO细胞HCP占总蛋白含量的0.05%以下。虽然目前国际上针对HCP 的残留限度尚无统一标准，但ELISA法是与国际接轨的常用抗体类药物HCP及Protein A残留的检测方法，也是目前《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》中推荐的检测方法。WHO及国内外药物监管机构要求，CHO 宿主细胞DNA残留量应不高于10 pg。《美国药典》（USP41-NF36版）指出，定量PCR法（q-PCR）的适用性较其他检测方法更好。q-PCR 法对样品的前期处理要求较高，但我国尚未建立统一的国家药品质量控制标准核酸信息平台和DNA残留量标准检测方法，抗体类药物中CHO宿主细胞残留DNA的检测均由各生产厂家自行检测。
4. 展望
随着抗体类药物研究的深入及分析技术的发展，质量源于设计（QbD）质量控制理念的推广，抗体类药物杂质分析正向自动化、高特异性、高准确度、高灵敏度、微型化及高通量实时快速检测的方向发展，如芯片实验室（Lab-On-Chip）技术在杂质残留检测领域不断发展与探索[6]；自动化处理平台高通量蛋白纯化、酶解、脱盐、多肽分级、糖链富集等自动化流程日趋成熟；高分辨质谱（HRMS）定性定量技术在过程开发及批放行中的逐渐普及。
这些分析技术的发展正推动着越来越多的新技术、新方法在抗体类药物杂质分析领域得到应用。同时，随着抗体类药物的临床应用，出现了越来越多的不良反应，对引起这些不良反应的相关杂质的深入研究将对抗体类药物的有效性、安全性和一致性的提升起到推动作用。
参考文献
［1］BUSS N A,MCFARLANE M，et al. Monoclonal antibody therapeutics：history and future［J］. Curr Opin Pharmacol，2012，12（5）：615-622.
［2］郭莎，武刚等，抗PD-L1抗体的质量控制研究。药物分析杂志，2019，39（1）：21-30.
［3］Beck, A., et.al. Characterization of Therapeutic Antibodies and Related Products. Anal. Chem. 2013, 85, 715−736.
［4］王兰，王军志等，重组抗体药物质控中物理检查的有关问题探讨。药物分析杂志，2015，35（11）：2036-2040.
［5］SCHILLING K，HOKZGRABE U. Recent applications of the charged aerosol detector for liquid
chromatography in drug quality control［J］. J Chromatogr A，2020，1619（1）：460911.
［6］HAJBA L，GUTTMAN A. Continuous-flow-based microfluidic systems for therapeutic monoclonal antibody production and organ-on-a-chip drug testing .J Flow Chem，2017，7（3-4）：118-123.
