1. 背景介绍
方法验证的目的是验证方法可以符合预期使用的目的。有关物质方法验证，即验证该有关物物质方法可以准确有效的对某种物料或者产品中有关物质进行检测和定量。按照ICH Q2（R1）分析方法论证：正文和方法学和中国药典9101分析方法验证指导原则，需要对以下指标进行验证：专属性，线性，范围、准确度、精密度（重复性、中间精密度）、检测限、定量限、耐用性和系统适用性试验。以上验证指标的标准均满足要求则方法验证通过，也就是符合预期使用的目的。那标准如何设定？本文将对各指标的标准制定进行讨论，本文内容为笔者经验之谈，如有不正确的地方，还请各位同仁予以指正。
2. 有关物质方法验证指标标准的制定
2.1. 耐用性和系统适用性
耐用性通常情况下应当在方法开发的时候进行，进行周密的方法设计，以保证方法的参数处于中间值，使方法具有好的耐用能力，对日后的放行，稳定性乃至标准复核时能更加顺利。一个好的方法应当具有良好的耐用性，尤其是有关物质方法，在方法参数存在微小变动的情况下，仍能够有效的对杂质进行定量，定量的基本前提需要满足系统适用性要求，所以耐用性的指标应当与系统适用性要求一致，如理论板数、拖尾因子、信噪比、系统精密度、分离度以及峰谷比。
理论板数：如规格为250mm×4.6mm，5μm或者150mm×4.6mm，3.5μm色谱柱，通常建议不低于1500，此外还应注意理论板数和保留时间（tR）呈正比，保留时间越小，理论板数越小。
拖尾因子：参考USP<621>，如果为含量测定，应在0.8-1.8之间，避免拖尾或者前延对定量造成影响。
信噪比：杂质测定时，为保证检测时仪器当下的状态可以有效检出杂质，通常使用报告限水平溶液，信噪比应不低于10。
系统精密度：在考察样品溶液之前，需要对对照溶液进行重复测定，通常测定6次，RSD%应不大于5.0%，如果限度特别低，如基因毒性杂质检测到，可以考虑适当放宽。
分离度：选择较难分离的一对杂质峰，或者主成分峰与相邻杂质峰，要求不小于1.5。可以使用添加杂质的样品溶液，或者使用正常样品溶液进行适当的降解。
峰谷比：如果两峰之间不能够达到基线分离，软件识别不到5%峰高处的峰宽，无法计算分离度时，可以采用该指标进行评估。虽然不能达到基线分离，但在采用指标评估时，方法的准确度，精密度都能够满足要求。峰谷比考察的溶液同分离度考察溶液。
耐用性还应进行溶液稳定性研究，对照溶液可参考系统精密度%RSD不大于5.0%，样品溶液可参考重复性标准。如果样品存在前处理，例如超声提取或者衍生等过程，也应该进行相应考察，应符合样品的质量标准。
2.2. 专属性
专属性考察，应进行各杂质定位的考察，稀释剂和辅料溶液的干扰，如为梯度方法还应考察梯度空白的影响以及添加杂质样品溶液的研究，应对各溶液的典型色谱图进行报告，要求稀释剂，辅料溶液和空白梯度峰不存在干扰，添加杂质样品溶液中，杂质峰与主峰的分离度应不低于1.5，杂质之间如果存在较难分离的情况，也可进行适当控制，但可以标准可以适当放宽，但前提应保证可以准确定量和重现。
专属性中还应进行降解研究考察，以证明方法具有稳定性指示功能，对样品进行适当的降解，模拟在稳定性末期可能会出现的杂质，即稳定性末期存在较多杂质的样品，该方法仍能够有效分离定量杂质。降解条件包括酸、碱、氧化、高温、光照。其中光照条件可参照ICH要求进行，如果产品对光比较敏感，存在二次降解，可降低累计光强度和紫外照度，同时放置控制样品进行比对考察。其他条件应进行适当的研究进行确定，但需要注意并非所有条件都要有降解，可能某些物质对某些条件并不敏感，我们不必过度研究。建议合理的降解程度为10%左右，并使物料守恒能够满足90%-110%，主峰的纯度应良好，不能有共流出物。
2.3. 检测限和定量限
定量限为当下方法能够满足定量的最低限度，因为定量的基质为样品溶液，所以如果仅对杂质标准溶液进行要求信噪比不低于10，不具有实际意义，因此应当保证定量限水平的杂质在样品溶液中可以准确定量，所以应结合准确度研究进行定量限的确定。因此定量限要求信噪比不低于10，还要求定量限水平的准确度满足要求，此外，定量限应不大于忽略限/报告限（通常为0.05%，参考ICH设定）。检测限要求信噪比不低于3即可。
2.4. 线性与范围
有关物质的研究范围应从定量限（≤忽略限/报告限）至150%或者更高，要求相关系数应不小于0.99，y轴截距不大于100%浓度水平峰面积的10%，在计算校正因子时，应注意扣除酸基和碱基以及纯度的折算，校正因子在0.9-1.1之间不需要进行校正。
2.5. 精密度
如果样品中杂质含量较低，应使用添加杂质样品溶液进行测定，平行制备6份，进行重复性考察，中国药典中9101的标准过于严格，审评中也不会按照该尺度执行，可以参考药品GMP指南第2版的 标准：检测值<0.1%：RSD≤25%；0.1%≤检测值<0.2%：RSD≤20%；0.2%≤检测值<0.5%：RSD≤10%；0.5%≤检测值<5%：RSD≤5%；5%<检测值：RSD≤2.5%；中间精密度因为同一实验室，仅不同人在不同天使用不同仪器实验，也可以参照此标准执行。
2.6. 准确度
在样品基质中添加已知量的杂质进行准确度研究，应至少研究3个水平，建议为定量限水平，限度水平，以及一个高水平，每个水平平行制备3份准确度溶液。回收率控制在80-120%之间，LOQ根据情况可适当放宽，如果杂质水平较高，应当适当收紧。如果样品溶液中本底过高，可能会存在超出范围的情况，应尽可能的获取杂质含量低的样品。如果不可获得，可以适当降低样品浓度以减小本底的干扰。
3. 结论
有关物质方法验证是非常重要的一项实验，各国的审计都非常关注，我们也应重点关注，验证之前，方法开发的工作一定要充分，并进行预验证工作，避免验证时候出现异常。验证最终的目的不是通过验证，而是获得一个可以有效分离能够准确定量杂质的方法。望本文对您有所帮助。
参考文献：
1. ICH Q2（R1）分析方法论证：正文和方法学
2. 中国药典9101分析方法验证指导原则
3. ICH Q1B 稳定性试验：新原料药和制剂的光稳定性试验
4. ICH Q3A（R2）新原料药中的杂质
5. ICH Q3B（R2）新药制剂中的杂质
6. 药品GMP指南 第2版 质量控制实验室与物料系统
